重庆地区22个STR基因座突变分析

张丹妍，杨玉有，杨智曦，李新生，吕 静，马明福，李练兵

（重庆市人口和计划生育科学技术研究院/国家卫生计生委出生缺陷与生殖健康重点实验室/重庆市正鼎司法鉴定所，重庆 400020）

短串联重复序列（short tandem repeats，STR）普遍存在于人类基因组中，是具有多态性的一类DNA序列。STR通常由2～6 bp核心序列串联重复而成，重复次数从几次到几十次不等[1-2]。STR具有种类多、分布广、多态性高、扩增成功率高、检测灵敏、重复性好、高杂合度、容易检测并遵循孟德尔共显性遗传规律等特点，在法医学亲子鉴定、个体识别及遗传病连锁分析等方面应用广泛[3-5]。但是法医学检案过程中，STR基因座的突变现象不少见，会一定程度上影响案件结论，因此，法医学实践中学者们对突变现象日益关注。在美国人群中，父源基因突变率在0.007%～0.371%之间（来自美国血库协会研究报道）[6]；而STR基因突变率国内学者研究报道在0.004%～0.404%之间[7-10]。本研究选择了2016年度重庆地区人群的1596例支持存在亲权关系的案件为观察研究对象，分析案件中22个常染色体STR基因座突变情况及特点，以期储备重庆地区STR 基因突变的基础遗传学信息。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1596例亲子鉴定案例均来自重庆市正鼎司法鉴定所的日常检测案例，三联体（父亲—孩子—母亲）亲子鉴定案件563例，二联体（父亲—孩子或母亲—孩子）1033例，鉴定结论均为支持存在亲权关系。家系案例样本大部分为血液或血斑，小部分为唾液斑、带毛囊毛发。

1.2 仪器和试剂

VeritiTM96-Well Thermal Cycler PCR 扩增仪（ 美国AB公司）；3130型或3500型DNA遗传分析仪（美国AB公司）；AGCU Expressmarker22 荧光检测试剂盒（简称AGCU Ex22 kit）和AGCU 21+1 STR荧光检测试剂盒（简称AGCU 21+1 kit）（中国无锡中德美联公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

样本的基因组DNA采用Chelex-100法提取。

1.3.2 PCR扩增

采用AGCU Ex22 kit对22个STR基因座（D3S1358、D13S317、D7S820、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、D16S539、Penta E、CSF1PO、Penta D、D10S1248、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391和FGA）及1个性别基因座Amelogenin进行聚合酶链反应（PCR）复合扩增。PCR扩增体系为10 μL，每管含Reaction Mix 4.0 μL、EX22 Primers 2.0 μL、热启动C-Taq酶0.4 μL、DNA模板1.0 μL（DNA浓度为0.5～2 ng/μL）和sdH2O 2.6 μL。PCR循环条件为初始变性95℃ 2 min，热循环（10个循环：94℃ 2 min，60℃ 1 min，72℃1 min；20个循环：90℃2 min，58℃1 min，72℃1 min），终延伸72℃ 10 min，保温4℃维持。每个扩增体系中设立阳性对照DNA为女性细胞株9947A和阴性对照（空白DNA用去离子水替代）。若出现1-2个不符合遗传规律的STR基因座，加测AGCU 21+1 kit。AGCU 21+1 Kit含22个STR基因座（D10S1248、D6S474、D12ATA63、D2S441、D22S1045、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D19S433、D6S1017、D4S2408、D17S1301、D2S1776、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D10S1435和D5S2500）及1个性别基因座Amelogenin，其中D10S1248、D2S441和D19S433这3个STR基因座为AGCU EX22 kit和AGCU 21+1 kit共有，可以进行复核比对。AGCU 21+1 kit的PCR扩增体系为10 μL，每管含Reaction Mix 4.0 μL、Primers 21+1 2.0 μL、热启动C-Taq酶0.3 μL、DNA模板1.0 μL（DNA浓度为0.5～2 ng/μL）和sdH2O 2.7 μL。每个扩增体系中设立阳性对照DNA为女性细胞株9947A和阴性对照（空白DNA用去离子水替代）。PCR循环条件为初始变性95℃ 2 min，热循环（30个循环：94℃ 30sec，60℃ 1 min，65℃ 1.5 min），终延伸60℃1 hour，保温4℃维持。

1.3.2 STR基因座检测

使用3130或3500遗传分析仪对扩增产物进行毛细管电泳，用Gene Mapper ID v3.2或Gene Mapper®ID-X软件对STR基因座进行分析。分型标准含分子量内标和等位基因分型标准物。

1.3.3 STR突变基因的确定

如果所有检测的22个STR基因座均符合孟德尔遗传规律，并且累计亲权指数（CPI）大于10000，则支持存在亲权关系。如果有1或2个STR基因座结果违反遗传规律或CPI在0.0001至10000之间，本研究增加AGCU 21+1 kit检测。参照司法部《亲权鉴定技术规范》（SF/ZJD0105001-2016）计算突变基因座的PI。如果增加检测试剂盒没有发现新的违反遗传规律基因座并且计算CPI大于10000，那么支持存在亲权关系。该违反遗传规律的基因座认为是突变基因座。如果CPI小于0.0001，认为排除存在亲权关系[11]。

1.3.4 STR基因座突变分析方法

突变步数即为重复单位的增加（+n）或者减少（-n）。在父母的等位基因中，突变基因以重复单位相差最小的亲代等位基因为准。如果步数相差相同，突变基因参考结构相似的等位基因。如果步数相同、结构相似即增加或者减少步数相同则判断为不能确定[9]。对突变基因座的数量、突变来源、突变步数及重复单位的增加或减少进行统计，通过直接计数法和EXCEL软件计算突变基因座的突变率。另外，分析突变来源、突变步数在整体突变事件中所占比例。突变相关因素之间的关系利用SPSS 15.0软件进行分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 STR基因突变座分析

1596例支持存在亲权关系的亲子鉴定案例中，二联体案件有1033例，三联体案件有563例，共观察到2159次减数分裂。研究中观察到52例突变（二联体案件有22例，三联体案件有30例），其中51例是父亲或母亲一方有1个基因座发生突变（98.11%），1例为父亲和母亲各有1个基因座发生突变（1.89%）。22个被检测的STR基因座中有20个座观察到突变，FGA基因座的突变率最高，为9次（0.42%），其次D12S391基因座为6次（0.28%），Penta E基因座为5次（0.23%），D8S1179和vWA基因座为4次（0.19%），D13S317、TH01和D2S1338基因座为3次（0.14%），D16S539、CSF1PO、Penta D、D10S1248和D6S1043基因座为2次（0.09%），D3S1358、D7S820、D21S11、D18S51、D5S818为1次（0.05%）。此外，D2S441和TPOX基因座未观察到突变（表1）。

STR基因座 突变例数 突变率（%） 一步突变 两步突变（-2） 三步突变（+3）+1 -1 +1或-1 +3 -3 D3S1358 1 0.05（1/2159） 1 D13S317 3 0.14（3/2159） 1 1 1 D7S820 1 0.05（1/2159） 1 D16S539 2 0.09（2/2159） 2 Penta E 5 0.23（5/2159） 2 1 2 TH01 3 0.14（3/2159） 1 1 1 D2S1338 3 0.14（3/2159） 1 1 1 CSF1PO 2 0.09（2/2159） 1 1 Penta D 2 0.09（2/2159） 1 1 D10S1248 2 0.09（2/2159） 2 D19S433 1 0.05（1/2159） 1 vWA 4 0.19（4/2159） 1 1 2 D21S11 1 0.05（1/2159） 1 D18S51 1 0.05（1/2159） 1 D6S1043 2 0.09（2/2159） 2 D8S1179 4 0.19（4/2159） 2 2 D5S818 1 0.05（1/2159） 1 D12S391 6 0.28（6/2159） 2 2 1 1 FGA 9 0.42（9/2159） 3 3 3合计 53 2.45（53/2159） 22 14 13 1 2 1

2.2 突变步数

STR基因座突变步数在52例突变案例中，共观察到53次突变，其中一步突变49次（92.45%），二步突变1次（1.89%），三步突变3次（5.66%）。一步突变现象里减少1个重复单位（-1）有12次，增加1个重复单位（+1）有22次，不确定是增加或者减少1个重复单位的13次；两步突变现象为减少2个（-2）重复单位；三步突变分别为2个（+3）和1个（-3）重复单位。突变等位基因的步数比较，差异有统计学意义（x2=126.423，P＜0.001）。

2.3 突变来源

在观察到的53次突变中，50次来源于父系，占94.34%，3次来源于母系，占5.66%，不能确定无。父系来源突变与母系来源突变的比例约16.67:1，差异有统计学意义（x2=83.358，P＜0.001）。

3 讨 论

3.1 STR基因座的突变率分析

研究STR基因座的突变率应该至少要观察500次细胞减数分裂[12]。本文采用AGCU EX22 kit检测并统计了1596例支持存在亲权关系的案例。研究结果发现共有2159次减数分裂，其中有20个基因座存在基因突变现象，突变率在0.05%～0.42%之间，略高于美国血库协会2008年公布的年度数据。针对基因座的结构和重复序列中核心序列的重复次数分析，发现突变率可能与基因座的多态性及片段长度有关。如核心序列重复次数大于10次的FGA、Penta E、vWA、D8S1179基因座突变率较高。通常应用于亲权鉴定的遗传标记STR的总突变率应不高于0.2%。本研究中FGA、Penta E、D12S391基因座的总突变率大于0.2%，因此在法医物证检案中应注意突变问题，必要时采取其他手段辅助鉴定以降低误判风险。此外，本次研究显示三联体的突变率是5.33%（30/563），二联体的突变率是2.13%（22/1033），三联体的突变率明显高于二联体，发生此情况的原因可能是二联体少了父亲或母亲一方的遗传信息，部分突变案例没能被发现。

3.2 STR基因座的突变机制及模式分析

STR基因座突变机制认为主要由于复制滑动或复制滑链错配引起。常用的STR基因座突变率在0.1%～0.5%。STR基因座的突变表现为重复单位数目的改变，主要分为两类：一步突变和多步突变[13-14]。串联排列的正向重复序列以及重复次数较多的序列中发生复制滑链错配的概率较大，突变率也相应较大。步数越少，发生突变的概率相对较大。另外一步突变可通过累积发生多步突变。STR基因座主要是以逐步突变模式发生，以单个重复单位的增减为主，占90%以上，两个或者更多重复单位改变较少见。本研究结果显示一步突变率为92.45%，明显高于二步和三步突变，与先前所报道的结果一致[15]。

3.3 STR基因座突变与性别、年龄

据李秋阳等报道，性别差异在突变现象中较明显，男性于女性发生突变的比例为8:1，此外突变与父亲年龄相关，突变率随父亲的年龄的增加也有增加趋势[16]。本研究显示父系与母系来源的突变存在显著的性别差异（比例为16.67:1），这和李秋阳等报道的结果一致。发生显著差异的原因可能是在男性精母细胞逐步分裂成精子的过程中，细胞需要的分裂次数比女性配子细胞成熟需要分裂的次数要多得多，所以产生突变的概率变大。本文观察到50例STR基因座突变来源于父亲，他们生育小孩的年龄最小25岁，最大54岁。

3.4 STR基因座突变的应对

在亲权鉴定案件中，按照司法部《亲权鉴定技术规范》（SF/ZJD0105001-2016）要求，鉴定中遗传标记累计非父排除率均应不小于0.9999，计算CPI＞10000视为支持存在亲权关系；CPI＜0.0001，则排除存在亲权关系。如果0.0001＜CPI＜10000，应通过增加检测的遗传标记来达到要求。本文用AGCU EX22 kit常规检测22个STR基因座，若所测基因座符合遗传规律，CPI＞10000，则支持存在亲权关系（1596例）。由于STR基因座在遗传过程中会产生突变，本研究在出现1～2个STR基因座不符合遗传规律加测了AGCU 21+1 kit。如果增测后没有发现不符合遗传规律的基因座，计算CPI 大于 10000，我们认为该STR基因座发生了突变（52例）。如果涉及的STR基因座突变案件中该STR基因座检测结果为纯合子时，我们会用IdentitiflerTM试剂盒对该样本重新检测，防止发生等位基因丢失（Null allele）而导致假突变现象。本研究中发现的52个突变案件，均检测了40个STR基因座，其中发现的STR基因座不符合孟德尔遗传规律均可能是在遗传过程中STR基因座发生突变所引起。我们后续将通过测序证实突变的来源，进一步对突变家系进行研究。