常染色体STR基因座母源突变的观察分析与亲权指数计算

兰菲菲 梁杰 胡听听 陈延冰 杜丽 张彦 尹爱华

短串联重复序列(short tandem repeat, STR)是人类重要的遗传学标记，由2～6个碱基组成核心序列，其串联重复次数不同形成长度不等的等位基因，构成个体差异和遗传多态性[1]。STR基因座具有分布广泛、多个基因座联合应用有较高非父排除率及多态性高等特点[2]。由于其遵循孟德尔遗传规律且检测方便快捷，目前STR基因座的检测分析广泛应用于亲子鉴定或个体识别的科学研究及鉴定实践中。鉴定的实际检测应用中发现STR基因座发生突变的情况较常见，且不同STR基因座的突变率有所不同[3]。有研究比较了国内不同地区人群的突变率，发现个别STR基因座在不同人群中的突变率也存在一定差异[4-5]。在STR基因座的突变情况中，父源突变较常见，母源突变发生率相对较低，文献报道的父源突变与母源突变比例平均约为3∶1[6-8]。由于母源性突变对鉴定结论及亲权指数计算的影响较复杂，在鉴定实践时应多予以关注。本文采用PowerPlex®21试剂盒检测20个常染色体STR基因座，观察分析10 271例亲子鉴定案例中STR基因座母源突变现象和特点，探讨母源突变基因座亲权指数计算方法，为法医物证的鉴定实践提供参考，丰富广东省汉族人群STR基因座的母源突变数据。

资料与方法

一、资料

血液、头发、羊水样本来源于广东省妇幼保健院医学遗传中心司法鉴定所日常受理检测的10 271例用于司法用途与个人了解的亲子鉴定案例，被检测对象为广东省汉族人群，签署知情同意书后采集受检者外周血或头发样本，羊水样本由医学遗传中心产前诊断医生采集。

二、 实验方法

1.DNA提取：实验血液与羊水样本应用Chelex-100法提取基因组DNA。灭菌的1.5 mL的离心管中加入1 mL灭菌纯净水，每个样本加入混合均匀的2 μL全血(羊水样本则在1.5 mL离心管中直接加入1 000 μL吹打混合均匀的羊水混悬液)，在震荡仪上剧烈震荡30 s后室温放置30 min。低温离心机中12 000 rpm离心3 min，丢弃上清液收集沉淀细胞。每个样本管中加入200 μL 5%的Chelex-100混悬溶液(头发样本将毛囊部位剪下浸泡于Chelex-100混悬溶液中)，剧烈震荡15 s后瞬时离心，放入恒温水浴箱中56℃孵育30 min后，移至100℃水浴中煮沸8 min，震荡完毕放入低温离心机中13 000 rpm离心3 min，吸取上清DNA约100 μL于新的1.5 mL灭菌离心管中保存于-20℃冰箱备用。

2.PCR复合扩增20个STR基因座的等位基因：采用Powerplex®21扩增试剂盒(美国Promega公司)，按照操作说明书在一个PCR反应管内进行20个常染色体(D1S1656、D2S1338、D3S1358等)和1个性染色体(Amelogenin)STR基因座多重等位基因位点的PCR复合扩增。扩增体系为Master Mix 5 μL；Primer Pair Mix 5 μL；DNA模板1 μL；超纯水14 μL。扩增条件为96℃ 1 min；(94℃ 10 s—59℃ 1 min—72℃ 30 s)30 cycles; 60℃ 10 min。

3.STR基因座的等位基因分型：对扩增后的PCR产物进行毛细管电泳，配制反应体系为PCR扩增产物1 μL；甲酰胺9 μL ；Powerplex®21试剂盒内标0.5 μL。充分混合均匀后，95℃变性3 min，立即放在冰上冷却3 min，用3500XL基因分析仪(美国AB公司)完成毛细管电泳。按照Powerplex®21试剂盒的操作说明，利用GeneMapper®ID-X软件(美国AB公司)，根据说明书给出的软件参数设置，分析毛细管电泳数据，以Powerplex®21试剂盒中的等位基因分型标准物(Allelic Ladder)作为分析参照，得到每个样本21个STR基因座的等位基因分型。

4. 统计学处理：分析母亲与孩子是否存在亲子关系，对于确定亲子关系的案件(累积亲权指数大于10 000)，孩子STR基因座的等位基因在母亲STR基因座的等位基因中找不到来源的，不符合孟德尔遗传定律时，则发生了母源突变，突变步数为STR基因座的核心重复序列增加或者减少的单位数量。统计发生突变基因座的数量及比例、突变步数、突变等位基因片段大小及其所占比例。

结 果

一、STR基因座母源突变情况分析

在Powerplex®21体系的20个STR常染色体基因座中，18个基因座发生了母源突变，D21S11发生突变的比例最高，占总突变数量的17.4%，其次是D12S391(15.1%)与PentaE(11.6%)，其他15个基因座突变数量小于10例(表1)，基因座的突变比例有所不同。

表1 18个母源性突变STR基因座的突变率与突变比例Table 1 Mutation rate and mutation ratio of 18 maternal mutant STR loci

如表2所示，在观察到的86例突变中，大部分均为一步突变95.4%，两步突变和三步突变各有2例，占比2.3%。在突变基因座的等位基因中，核心重复序列增加的有44例(51.2%)，减少的为28例(32.6%)，未能明确的有14例(16.3%)。其中两步突变增加与减少2个重复序列各有1例，三步突变的2例均为增加3个重复序列。在86例母源突变的STR基因座中，发生在短等位基因的2例(2.3%)，中等位基因的75例(87.2%)，长等位基因9例(10.5%)(表2)。

二、增加STR基因座检测对STR基因座母源突变亲权指数的影响

如表3所见，本文中观察到的一步突变均无需增加STR基因座检测，包括计算的突变STR基因座亲权指数在内，即可达到结果判读要求(累积亲权指数大于10 000为支持亲子关系；累积亲权指数小于10 000为排除亲子关系)[9]，其累积亲权指数范围为104～1011。两步突变及三步突变对STR基因座亲权指数数值影响较大，需增加STR基因座检测数量以得到正确鉴定结果与结论。

表4中STR基因座突变案件中，包含突变STR基因座在内的Powerplex®21体系20个常染色体STR基因座的累积亲权指数未大于10 000，无法达到鉴定结果判读条件，采用STR-typer10G(珠海科登生物工程有限公司)或MicroreaderTM23sp ID体系(苏州阅微基因技术有限公司)增加STR基因座的扩增检测，经过计算增加检测后两个体系的全部STR基因座累积亲权指数，均能够得出支持亲子关系的鉴定结论。

表2 STR基因座母源突变的特点Table 2 Maternal mutation characteristics of STR loci

表3 54例母源性基因座突变情况及亲权指数计算Table 3 Mutation of maternal loci and paternity index calculation in 54 cases

表3(续)

表4 增加STR基因座检测后鉴定结论明确的案件分析Table 4 Cases analysis of precise conclusion by adding STR loci detection

表4(续)

三、突变基因座的亲权指数计算

根据《亲权鉴定技术规范》[9]的要求，突变的STR基因座应参与计算累积亲权指数，因此，发生母源突变的STR基因座应按照不同情形分别计算其亲权指数，具体情形及计算公式可参见图1。

图1 母源突变STR基因座的亲权指数计算Figure 1 Paternity index calculation of maternal mutant STR loci

讨 论

STR基因座的突变在法医物证鉴定实践中较常见，国内外均有关于不同STR基因座的突变报道[10]。STR基因座的突变以逐步突变模式为主，目前普遍认为其发生机制是由于DNA在复制过程中发生滑动或者错配而导致STR基因座重复单位数目的变化，主要表现为增加或者减少一个重复单位的一步突变，约占突变现象的90%[11]。重复单位数目多的基因座片段长度相对较大，观察到的突变现象较多[12]。由于精子与卵细胞在分化过程中的细胞分裂次数不同，STR基因座突变中也存在突变来源的性别差异，精细胞发生的DNA复制多，发生滑动或者错配的几率相对较大，来自父亲的父源性突变发生率较母源性突变高[13]。中国不同地区人群STR基因座等位基因频率具有一定差异，因此，不同地区人群STR基因座突变率也有所不同，研究发现河南省汉族人群的Penta E、D6S1043及D12S391等基因座突变率与北方地区、广东省、云南省人群有显著性差异[14-15]。而在STR基因座突变相关的研究中，常染色体STR基因座母源性突变特点的分析及亲权指数计算鲜有报道。

PowerPlex®21体系是亲子鉴定案件应用较广泛的检测试剂盒，包括20个常染色体STR位点和1个性染色体位点，目前对该试剂盒STR基因座母源性突变的专题报道较少见。本机构自2013年开始在鉴定实践检案中应用PowerPlex®21试剂盒，在本文中观察了10 271例亲子鉴定案例突变情况，发现了86例STR基因座的突变来源于母亲，突变率在0.003%～0.05%之间。其中82例为一步突变，两步突变与三步突变各2例。

一、STR基因座突变的真实性分析在应对母源性STR突变位点的作用

STR基因座突变的本质是不符合孟德尔遗传规律的现象，是在鉴定案件存在亲子关系的考虑下，个别出现不符合遗传规律的STR基因座。因此，真实发生的STR基因座突变与所用的检测试剂盒无相关性，不同试剂盒检测到的突变STR基因座等位基因分型应相同，遇到STR基因座突变时条件允许可利用不同检测体系进行确认。同时观察分析突变STR基因座的峰高和峰面积，排除STR基因座发生了等位基因丢失现象[16]。

二、突变STR基因座的亲权指数计算在应对母源性STR突变位点的作用

亲子鉴定的父权指数计算是基于母亲为生物学母亲的前提，母亲如果存在不符合孟德尔遗传规律的STR基因座等位基因，考虑可能存在以下两种情况。

1.母亲是生物学母亲，不符合遗传规律的STR基因座为母源性突变，可根据三联体亲子鉴定或二联体亲子鉴定进行计算，具体为：(1)父母子三联体的亲子鉴定，要求鉴定是否为生物学父亲时，母亲STR基因座突变可以考虑先分析母亲与孩子的亲子关系，确定为生物学母亲后，根据《亲权鉴定技术规范》[9]中三联体不符合遗传规律的亲权指数计算方法计算突变STR基因座的父权指数。(2)只有母亲与孩子参与的二联体亲子鉴定，突变基因座的亲权指数按照《亲权鉴定技术规范》[9]中二联体不符合孟德尔遗传规律情形时的公式计算，分为几种情况(以发生一步突变为前提)，即①母亲与孩子均为杂合子，PI=μm/(8Pb) ；例如表3中D2S1338基因座，母亲等位基因分型为20, 25，孩子为18, 19，PI=μ/(8P19)。②母亲为纯合子，孩子为杂合子或者母亲为杂合孩子为纯合，PI=μm/(4Pb)；例如表3中D5S818基因座，母亲分型为9, 12，孩子分型为13，PI=μ/(4P13)。③母亲与孩子均为纯合子或母亲是杂合孩子是纯合且有两种等位基因突变可能性，PI=μm/(2Pb)；例如表4中TPOX基因座母亲分型为9，孩子分型为9，PI=μ/(2P9)。④母亲与孩子均为杂合子，两个等位基因均发生了突变，PI=μm(Pa+Pb) /(8PaPb)；例如表4中FGA基因座，母亲分型为22, 24.2，孩子分型为21,23.2，PI=μ(P21+P23.2)/(8P21P23.2)。⑤母亲为纯合子，孩子为杂合子，且有两种等位基因突变可能性，PI=μm(Pa+Pb) /(4PaPb)。⑥母亲与孩子均为杂合子，但其中一个等位基因有两种突变可能性，另一个等位基因有一种突变可能性，PI=μm(2Pa+Pb) /(8PaPb)。例如表4中D8S1179基因座，母亲分型为15,17，孩子分型为14,16，PI=μ(2P14+P16)/(8P14P16)。Pa与Pb分别为孩子突变STR基因座等位基因a或b的频率，μm为女性突变率，可取值0.0005[9]。

2.母亲不是生物学母亲，该情况可出现一个或多个STR基因座不符合遗传规律。以下情形可能会导致该种情况的发生，例如委托人隐瞒真实情况，孩子是母亲的近亲；母亲或孩子是嵌合体，体内存在至少2种不同细胞系，外周血液基因型与身体其他器官基因型不相同，异源嵌合体案例及相关研究报道也是法医学的研究热点[17]。三联体的亲子鉴定案例，如果确定不是生物学母亲，可按照双亲皆疑的方法计算父权指数[18]。二联体亲子鉴定案例可根据《亲权鉴定技术规范》[9]中二联体不符合孟德尔遗传规律情形时的公式计算亲权指数。当委托人隐瞒真实的情况下，鉴定结果可能会出现与肯定亲子关系突变相类似的结果，即只有个别基因座出现不符合遗传规律现象，容易将实际是排除的基因座位点按照突变的方式处理，导致错误的鉴定结论，可考虑加做STR基因座检测位点以排除近亲血缘关系的干扰，防止亲子鉴定结果的误判，得出正确的鉴定结论。

STR基因座母源性突变相对于父源突变具有发生率低、分析计算较复杂、易导致结果误判等特点，本文在PowerPlex®21体系中观察到广东省人群发生的86例母源突变，涉及18个STR基因座，95.4%为一步突变，发生在中等位基因的突变较多(87.2%)，核心重复序列的增加导致的突变占多数51.2%。文中详细分析了发生在不同情形时的母源突变STR基因座的亲权指数计算，为应对亲子鉴定中母源突变STR基因座的鉴定案例提供参考，为丰富广东省汉族人群母源STR突变数据库提供遗传信息支持。