微生物制药中菌种准备方法及改进

王丽琴

（杭州中美华东制药有限公司，浙江杭州 310000）

微生物制药主要利用微生物代谢过程中产生的有生理活性的产物，针对生产过程的特殊性，在整个过程中需要明确实际类型，结合制药类型和模式等实施。当前，微生物制药实验管理程度复杂，考虑到代谢条件以及相关实验设备等因素，要从实验环节入手，提升生产管理水平。为了保证生物菌种的安全性，要求实验人员从各个实验环节做好准备工作，满足微生物制药要求。

1 传统的供种方法

四环素是由金霉素链霉菌经孢子制备、种子培养、发酵和提取而获得的。根据发酵以及提取精制过程可知，菌种制备是源头，需要提前做好准备工作，以满足实验要求。在初期制备阶段，相关实验人员进行试验、如下：36 ℃培养7天左右，以F1代子斜面，为了保证实验所需数量和孢子质量，要扩大培养F2代子斜面，设计人员在实验的过程中，按照不同类型要求进行。传统的供种模式存在很多问题。

1.1 菌种的斜面转接困难

菌种的斜面转接是用接种环轻轻沾取一个试管中少量菌体和孢子，转接到另外一支待接斜面试管上，但由于实验人员较多，需要重复转接的斜面较多，考虑到整个过程的特殊性，在整个分析阶段，需要高度重视，做好制备工作。

1.2 斜面需求量大

微生物生长的影响因素较多，可能存在生长情况不好的现象。技术人员要结合多年的经验，结合试验菌的特征进行，此外考虑到形态和生理变异等因素，为了保证给其他工作人员提供符合试验要求的菌种，以试验项目为基础，根据《医疗卫生机构医疗废物管理方法》可知，需要提前确定使用规范，试验结束后，对试管斜面提前处理，工作量较大，如果存在试验制备不合理或者其他问题等，都可能造成不良影响[2]。

1.3 供种时间性强

受到其他因素的影响，如湿度、温度和原材料等，菌种控制难度比较大，在整个处理阶段，要做好处理工作。如果不能提前控制，菌种则易出现衰退、死亡或者变异等现象，导致生产能力下降后，时间不好掌握[3]。

1.4 出发菌株不能统一

由于每个出发菌株的单一孢子转接试管斜面的数量有限，不能保证所有研究人员所进行的实验组的使用生长情况一致，根据试验数据实际情况可知，这种情况不利于发酵过程中代谢条件的开展。在微生物制药实验中，考虑到菌种的准备形式以及异常情况，要提前进行研究和实践。

2 改进菌种准备方式和可行性分析

2.1 改进方式

由于菌种的类型较多，在整个分析阶段，要了解菌丝体的实际情况。根据液体培养基的概况可知，震荡培养的方式符合要求。以菌丝体保存方式为例，将震荡培养后的菌丝体加保护剂后分装至甘油管中，置于-28 ℃下进行保存。冷冻菌丝体代替孢子斜面，将其提供给相关人员进行项目试验，如下：

沙土管→孢子培养→母斜面→种子液→供种

结合传统的微生物制药的模式可知，培养成熟孢子母斜面，以接种处理作为基础，在后续试验中，要做好种子液处理工作。每瓶菌丝萌发的种子液可以分装至多个甘油管中，置于合适的温度下保存，完成后续试验。该方式的优势明显，种子和孢子斜面用量少，在实验检查阶段，需要明确准备方式和要求，严格按照试验要求实施。斜面传代的时间和后续大量的菌种灭活后洗刷工作量提升，需要节约人力、物力等投入，减少感染机会，保证稳定生产和管理。此外种子生长较快，能加速孢子发芽，根据对应的菌种以及准备周期可知，在改进处理过程中要明确实际优势，提升了可行性。同一批次的菌丝体生长背景一致，在发酵过程中，考虑到代谢条件以及试验设计等要求，要明确可行性指标，避免出现异常现象[4]。

2.2 菌丝体冻存时间分析

根据不同时间的菌丝体试验条件可知，5%四环素接种量发酵过程中，采用新鲜的孢子斜面作为对照，能符合结果要求。冻存菌丝体作为试验的主要部分，冻存两周后，菌丝冻存时间延长后，四环素发酵单位呈现出下降趋势，冻存1周后，菌丝变化不明显，考虑到周期性变化和改进流程可知，需要提前减少工作量[5]。

2.3 菌丝体接种量对四环素发酵影响考察

冻存时间以及菌丝体等属于常见的试验供种，结合不同接种量可知，在评价过程中，要提前处理，以新鲜孢子斜面供种为对照组，在测评阶段要明确表格内容，按照改进格式要求实施。综合分析试验结果可知，在实验调查过程中，要确定大范围的结果。冻存1周的菌丝体供种发酵考察见表1。

表1 冻存1周的菌丝体供种发酵考察

菌丝体冻存的时间大约为7天，接种量为2 mL，转种时间为22 h时，发酵单位和普通孢子发酵单位相当，如果没有下降，则可以按照说明书代替传统斜面进行处理。

2.4 不同供种方式工作量对比

根据微生物实验检测的实际要求可知，做好分组管理是关键。正常情况下，实验项目分配后，要确定成熟孢子斜面类型，如果孢子不能符合实际要求，则准备32支以上的孢子斜面。以试管装量为前提，要提前确定培养基数量。改进的供种方式需要一只斜面，挖块1 cm×2 cm孢子接种到液体培养基内，震荡培养是重要的过程，在简化处理的过程中，要明确类型要求，简化后的试验处理是个重要的过程，洗刷后，要提前确定工作量[6]。

2.5 确定培养周期

根据改进后的菌丝体供种类型可知，供种时间分为不同的类别，周期大约为1周。由于微生物制药管理过程复杂，在实践阶段需要考虑到应用周期和概况，做好斜面准备以及孢子培养工作，确定斜面的数量。以试验数据作为基础，冻存菌丝体作为四环素发酵的供种来源，如何将其应用到大范围中是重点，以规模化管理作为基础，复杂的培养管理后，能适当减少试验准备操作，缩短时间。试验准备是个全面的过程，冻存2周后，四环素发酵单位呈现出下降的趋势，考虑到应用周期和其他方面因素的变化，在整个处理过程中要突出应用重点。

3 结语

微生物制药管理是个全面的过程，考虑到应用周期以及具体变化，大规模实验人员在实验分析的阶段，必须做好菌种准备工作，考虑到实验准备操作以及时间等方面因素，生物废品较多，做好后续处理工作是重点，要改善实验环境，节约人力和物力投入等。实验周期的确定也是重点，在评价过程中需要确定接种量，如果存在准备不到位或者改进措施不合理等现象，则直接影响试验结果，因此需要从各个方面入手，做好改进工作，最大程度满足应用要求，实现菌种合理性。

[1]刘晓辉,郭萍,韩佳迪,等.微生物制药实验中菌种准备方法改进[J].实验室科学,2017,20(5):36-38,41.

[2]裴立忠,王勇平,张鹏,等.四环素类抗生素生产状况与市场发展前[J].中国兽药杂志,2015,12(1):96-98.

[3]何健勇.生物制药工艺学[M].北京:人民卫生出版社,2016.

[4]祝琳.微生物实验室菌种复苏传代保存流程[J].山东化工,2014,43(1):105-106.

[5]范慧.菌种管理在抗生素生产中的应用[J].药学研究,1999(1):60-62.

[6]杨怡姝,沈思嗣,王小利,等.大学生物学实验室的生物安全问题探讨[J].实验技术与管理,2011,28(5):188-190.