广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的分子保护作用研究

李冠烈，汤少娴，饶智华，牛丞威，陈乐诗，陈泽程，张韦深，龙天澄,，汪雪兰，刘琼*

（1.中山大学 新华学院，广东广州 510520；2.中山大学 医学院，广东广州 510520）

冠心病（coronary heart disease，CHD）对中老年人的健康有着严重的影响，随着人们生活方式的改变、饮食结构的变化，该病症逐步发生在青年人群中[1-2]。引起该病症的主要原因是心肌缺血后产生大量的活性氧自由基，对心肌细胞造成损伤，复灌后导致氧化损伤加重[3-4]。研究有效的治疗缺血再灌注损伤的药物，改善CHD患者的治疗效果，有重要意义。

中医在治疗方面，以中草药为主，对心肌缺血的预防和保护有较大进展。其中，总黄酮因能够保护心脑血管、抗癌而受到医学研究的重视。广金钱草的统一药用名称源于《岭南草药志》，在治疗泌尿系感染、泌尿系结石、小儿疳积、痈肿等方面，有较好的治疗效果[5-6]。有报道，极性较大黄酮能增加狗在体心脏冠脉流量及减少心肌耗氧量，可能和扩张冠状动脉、减少心肌耗氧量，改善心肌缺氧有关系[7-9]。因为中药成分复杂，各种成分含量低，研究技术手段等制约了对其心肌缺血保护作用机制的进一步研究。国外对广金钱草研究主要集中在其生物碱、黄酮苷、酚类等各物质的化学成分的构成上，对广金钱草总黄酮对心脏缺血/再灌注损伤的分子保护作用研究暂未见太多报道[10-11]。大鼠的冠脉走形和血液循环途径与人类接近，模型稳定性较好，可用于探索研究。离体心脏不受神经体液的调节，影响因素较少、可控性强，是一种可选模型[12]。本文研究了广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的分子保护作用，采用Langendorff离体心脏灌流技术复制心肌缺血模型，通过设置对照组和4个不同浓度用药组，观察广金钱草黄酮是否对心肌缺血/再灌注损伤有保护作用，初步探讨从分子水平对心肌保护作用机制，为其临床应用以及中药进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：雄性Wistar大鼠25只，体重300～350 g，平均体重为（321.46±7.48）g。

实验药品：肝素钠（上海第一生化药业有限公司，国药准字H31022051），戊巴比妥钠（美国Sigma公司，高级纯），其他试剂均为分析纯。

实验设备：Langendorff、恒温水浴、电子天平、pH仪、蠕动泵、多导生理仪、缝合针和导管等。

1.2 建立大鼠离体心脏缺血/再灌注模型

大鼠断头后，迅速开胸，取出心脏，洗净血液，迅速转移、固定，常规恒压灌流，维持灌流液温度37 ℃。缺血/再灌注的过程为平衡20 min，停止灌流30 min，复灌120 min。

1.3 方法

采用2010年版《中华人民共和国药典》广金钱草总黄酮制备方法。

称取广金钱草干品约6g，加80mL95%乙醇，超声波提2.5h，抽滤。滤渣以同法提取2.5h，抽滤，两次滤液合并，用旋转蒸发仪浓缩至一定体积，将浓缩液转入100mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品液，测得样品中总黄酮的含量C=0.148mg/mL。

大鼠25只，分5组，分别是对照组（仅做灌流，不停灌和用药）、A组（停灌前未用广金钱草总黄酮处理）、B组（广金钱草总黄酮低浓度1 μg/mL）、C组（广金钱草总黄酮中浓度10μg/mL）、D组（广金钱草总黄酮高浓度100 μg/mL），具体如下。采用Langendorff离体心脏灌流技术记录心脏功能。大鼠斩头后，迅速开胸腔取出心脏，经主动脉进行插管，心脏悬挂于Langendoff灌流装置上，用37 ℃氧饱和的K-H液，充以5%CO2和95%O2混合气体20 min，调节其pH值为7.35～7.40，灌流方法为恒温、恒压逆向灌流，灌流压力设定为11 kPa。经房室口将一注水球囊插入左心室，小囊经导管和压力换能器进行连接，把左心室内压输入Powerlab生物信号采集处理系统，进行信号的自动采集、记录。对心肌梗死及氧化应激损伤测定心脏，复灌时间延长至120 min。各组仅在广金钱草总黄酮所用浓度方面有差异，其他均一致。

1.4 观察指标

观察广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血/再灌注血流动力学、心肌梗死程度、冠脉流出液中LDH含量的影响。

大鼠Langendorff离体心脏灌流技术，采用ADInstruments公司的设备及配套PowerLab信号采集分析系统。

心肌梗死面积测定：冷冻保存、切片、TTC 染色、拍照、用Motic Med 6.0图像分析系统分析处理图像、计算百分比。

心脏流出液中乳酸脱氢酶（LDH）检测，用南京建成生物技术公司的试剂盒，用分光光度法检测。

1.5 统计学分析

使用IBM SPSS Statistics 22统计学软件进行本研究数据分析，计量数据用（x-±s）表示，计数数据用百分比（%）表示，分别用t和x2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对大鼠离体心脏缺血/再灌注血流动力学的影响

广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血/再灌注血流动力学的影响见表1。结果表明，大鼠各项心功能指标在复灌期间都出现了异常，和生理盐水组比较，A组的RPP、±dP/dtmax、CF均显著下降，表明缺血/复灌模型建立成功。不同浓度的广金钱草总黄酮能够改善缺血缺氧引起的血流动力学改变，减轻因缺血/再灌注造成的心肌损伤，有统计学差异（P＜0.05）。

2.2 对大鼠离体心脏缺血/再灌注心肌梗死程度的影响

广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血/再灌注心肌梗死程度的影响见图1。结果表明，离体心脏停灌前，采取广金钱草总黄酮进行预处理，和A组比较，可以调节心肌formazan含量，降低心肌梗死面积，有统计学差异（P＜0.05）。

图1 广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血/再灌注心肌梗死程度的影响

2.3 对大鼠离体心脏缺血/再灌注冠脉流出液中LDH含量的影响

表1 广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血/再灌注血流动力学的影响（x-±s）

广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血/再灌注冠脉流出液中LDH含量的影响见图2。离体心脏停灌前，采取广金钱草总黄酮进行预处理，和A组比较，可以降低心肌冠脉流出液中LDH的含量，有统计学差异（P＜0.05）。

图2 广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血/再灌注冠脉流出液中LDH含量的影响

3 讨论

研究结果显示，不同浓度的广金钱草总黄酮均能改善缺血缺氧引起的血流动力学改变，减轻因缺血/再灌注造成的心肌损伤，有统计学差异（P＜0.05）。血流动力学是评价心功能的主要参数。由此证实，广金钱草总黄酮对于改善缺血/再灌注造成的心肌损伤方面，能够改善心脏功能，效果较好。

现代药理学研究表明，广金钱草有利胆、利尿、抗泌尿系结石、对心血管系统有影响、抗炎、镇痛抗菌、益智、对血液有影响等[13-14]。急性心肌缺血损伤，梗死面积的大小直接影响到治疗效果[15-16]。研究结果显示，离体心脏停灌前，采取广金钱草总黄酮进行预处理，和A组比较，可以改善心肌formazan含量，降低心肌梗死面积，有统计学差异（P＜0.05）。缩小心肌梗死的面积，是治疗效果的主要判断依据。

LDH广泛存在于细胞浆膜中，在正常情况下，其含量降低。研究结果显示，离体心脏停灌前，采取广金钱草总黄酮进行预处理，和A组比较，可以降低心肌冠脉流出液中LDH的含量，有统计学差异（P＜0.05）。由于发生了细胞膜和线粒体的损伤，使得细胞膜的通透性增加，造成LDH的变化。其水平降低，表明减少了心肌损伤的情况。

总之，广金钱草总黄酮对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤有较好的分子保护作用，可以减轻因缺血/再灌注造成的心肌损伤，改善心肌formazan含量，降低心肌梗死面积，降低心肌冠脉流出液中LDH的含量。

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