成年兔桡骨骨缺损模型的骨缺损长度探讨

宋子鉴, 郑 欣, 王 进, 张星晨, 郭开今

(徐州医科大学附属医院骨科, 徐州221000)

大段骨缺损可由于严重创伤、感染、肿瘤或先天性肌肉骨骼疾病等引起[1]。骨缺损作为一种常见病，依然是骨科领域所面临的临床难题。随着组织工程技术的发展，多种新型支架材料已成为了广泛应用的骨替代材料[2-4]。

为了评价各种材料的理化或生物学特性, 需要建立合适的骨缺损动物模型。近年来关于骨缺损及其修复的研究较多, 所选动物也不尽相同[1,5], 而理想的动物模型能为医学研究提供有价值的参考数据。兔作为一种常见的实验动物，在骨愈合研究中被广泛使用[6]。年龄与骨缺损修复密切相关, 多种与年龄相关的因素影响着骨愈合的发生[7]。然而, 对于兔龄选择目前尚无统一定论。既往研究中制备兔桡骨骨缺损模型主要为幼年兔[8-11], 有关成年兔构建大段骨缺损模型的实验较少。一般认为, 在5～8月龄间新西兰兔完成其骨生长, 8月龄时已完全成年[12]。本研究选择8月龄新西兰兔，就成年新西兰兔构建骨缺损模型的临界性缺损值进行了实验探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取8月龄清洁级新西兰雄兔18只，体质量(4.14±0.29) kg, 由江苏省动物实验中心提供[SCXK(苏)2014-0005]。动物饲养室内对温度和湿度进行连续监测，维持气温20～26 ℃, 相对湿度40%～70%[SYXK(苏)2015-0029]。所有实验兔均单笼自由活动，由专业人员喂养。

1.2 主要试剂仪器

质量分数3%戊巴比妥钠、青霉素、地西泮、HE染色试剂; 常用骨科手术器械、计算机断层扫描仪(德国Siemens公司，Definition Flash)。

1.3 动物分组与制备模型

18只兔根据桡骨缺损长度分为A、B、C三组,其缺损长度依次为: 10 mm，12 mm, 15 mm, 每组各6只，双侧手术计12侧。

采用质量分数3%戊巴比妥钠溶液1 mL/kg耳缘静脉注射，麻醉后兔取仰卧位固定于手术台，双侧前臂备皮，术区消毒、铺巾，在前臂桡侧中段做切口，对皮下组织及深筋膜逐层分离，经肌间隙暴露桡骨干。以桡骨的弧顶为中心用小型摆锯将桡骨截除，制作相应长度骨缺损。截骨后切除断端约5 mm长骨膜及尺桡骨骨间膜，生理盐水冲洗并逐层缝合关闭切口。术后连续3 d以肌肉内注射青霉素40万单位预防感染。

1.4 观察指标

1.4.1 大体观察 术后观察动物的精神状态、进食活动等一般状况及切口处有无感染表现, 术后12周处死动物，取出尺桡骨标本，肉眼观察各组标本骨痂生成及断端是否出现骨连接等情况。

1.4.2 影像学观察 所有实验兔分别在术后当日及术后4周、8周、12周，行双侧前臂CT平扫,实验中由同一位医务人员以相同扫描条件进行CT检查，以保证实验条件一致性。通过CT信号值变化, 观察各阶段断端新生骨生成量，并完成Hedberg评分。Hedberg评分是根据新生骨占缺损区域比例将0%到25%计1分，25%到50%计2分，50%到75%计3分，75%到100%计4分。

1.4.3 组织学观察 于术后12周处死动物, 取尺桡骨标本，缺损断端保留5 mm正常骨组织，体积分数10%甲醛固定24 h后双蒸水冲洗干净，质量分数10%二乙胺四乙酸钠脱钙液脱钙。冲洗干净后经乙醇溶液(30%-50%-70%-100%)逐级脱水，石蜡包埋，沿标本的纵轴制备骨组织切片，经HE染色封片后，光学显微镜下观察。

1.5 统计学分析

应用SPSS13.0统计学软件进行统计分析, 各评分数据以±s表示，组间各时间点CT-Hedberg评分结果进行多样本方差分析,P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

兔在麻醉清醒后，精神萎靡，活动较少。术后24 h，各组兔精神状态好转，觅食饮水正常。术后切口周围有不同程度的肿胀，3～6 d肿胀渐消退。术后10 d左右手术切口愈合良好，无明显破溃、渗出等感染表现，所有实验兔均如期存活。

2.2 大体观察

术后12周处死动物，A组12侧与B组11侧(91.7%)桡骨断段均有连续性桥接骨痂通过, B组1侧(8.3%)未愈合, 断端呈楔形骨生长。其中A组10侧(83.3%)与B组8侧(72.7%)新生骨表面已较为光滑，形态与自身桡骨基本一致(图1A)，C组所有标本均未完成修复，桡骨断段及相邻尺骨仅有少量新生骨痂，缺损区域由纤维组织填充(图1B)。

图1 兔桡骨大体观察Figure 1 Gross observation on radius of rabbit

2.3 CT观察

术后当日CT图像显示各标本骨缺损区清晰可见，无碎骨屑残留，断端整齐(图2)。缺损长度10 mm的A组与缺损12 mm的B组术后4周均可见断端有大量新生骨痂生长，密度较正常骨组织略低，新生骨形态不规则(图3左、中); 术后8周断端的新生骨痂密度增高，形态较之前规则，已有明显骨连接的趋势(图4左、中); 术后12周骨缺损区完全愈合, 骨皮质连续，与正常桡骨形态基本相似(图5左、中)。缺损长度为15 mm的C组术后4周有3只实验兔出现尺骨骨折，其中2只双侧尺骨均骨折, 1只为单侧尺骨骨折，故C组记7侧进入统计。其余未见骨折的桡骨断端及邻近尺骨侧仅有少量新骨生成(图3右); 术后8周未见明显骨生长,可见部分髓腔闭塞(图4右); 术后12周髓腔完全闭塞, 断端可见高密度硬化骨(图5右)。术后4周、8周和12周各时间点的CT-Hedberg评分显示，C组明显低于A组和B组，组间差异均有统计学意义(P＜0.05)，但A组与B组间差异无统计学意义(P＞0.05)(表 1)。

2.4 组织学观察

术后12周组织学观察可见A组和B组大多数标本已修复完全，可见大量成熟骨小梁，髓腔再通(图6A、6B); C组缺损断端髓腔封闭，断端及靠近尺骨侧有少量新生骨组织，中央缺损区由纤维结缔组织填充(图6C)。

图2 术后当日兔桡骨CT观察Figure 2 CT images on radius of rabbit on the day of operation

图3 术后4周兔桡骨CT观察Figure 3 CT images on radius of rabbit at 4 weeks after operation

图4 术后8周兔桡骨CT观察Figure 4 CT images on radius of rabbit at 8 weeks after operation

3 讨论

临界性骨缺损(critical size defect, CSD) 是指缺损后不进行任何处理无法自愈的最短的骨缺损长度[13]。Schmitz等[14]曾指出动物负重管状骨的CSD长度应是其周径的1.5～2.5倍或其长骨长度的10%以上。我们前期通过影像学观察测量，8月龄新西兰兔桡骨中段周径约为8 mm，长度约为73 mm。参考了李东亚等[11]的新西兰兔桡骨骨缺损模型, 本实验分别选择10 mm、12 mm及15 mm三组骨缺损尺寸。不同月龄兔成骨能力不同，在生命的最初1个月里，增长最快。1个月到2个月之间逐渐放缓，2个月后甚至减慢更多。而新西兰兔完成骨生长的月龄是5～8个月[12]。因此，对于月龄的选择也是影响实验结果的重要因素。虽然国内外对于构建桡骨骨缺损模型已有不少报道，但多数学者选用4～6月龄兔作为实验动物[9,10,15,16]。在临床中，更多的大段骨缺损患者为成年人。因此，构建成年兔桡骨临界性骨缺损模型对临床应用和基础研究可能具有更重要的实用价值。8月龄新西兰兔已处于成年期[12], 避开了骨生长旺盛期且骨骼生长基本趋于停止, 更能代表成年兔进行骨缺损模型的制备。李东亚等[11]在兔桡骨骨缺损实验中选取了6月龄新西兰兔分为10 mm、15 mm、20 mm三组，术后12周可见10 mm组断段已完全愈合，15 mm、20 mm组断段未愈合，基于上述结果，他们认为6月龄新西兰兔制作桡骨CSD模型选择15 mm较合理。Zhou等[10]在其实验中选取了4月龄新西兰兔制作了15 mm长度的桡骨骨缺损模型，所有空白组术后4周及8周取标本进行观察，结果均无缺损愈合。本实验结果显示: 8月龄兔C组(15 mm缺损)，其修复能力较A组(10 mm)与B组(12 mm)差异有统计学意义，表明8月龄新西兰兔桡骨CSD长度选择15 mm较为合适。

表1 术后不同时期CT-Hedberg评分表Table 1 Scoring of postoperative CT-Hedberg

图5 术后12周兔桡骨CT观察Figure 5 CT images on radius of rabbit at 12 weeks after operation

图6 术后12周兔桡骨组织学观察 (HE×40)Figure 6 Histological observation on radius of rabbit at 12 weeks after operation

本实验在术后4周进行CT观察，显示C组部分兔发生尺骨骨折现象。原因可能是由于选择了月龄较大的新西兰兔进行实验，其体质量较大。作为负重骨，桡骨缺损后单独尺骨无法承受增大的应力。另外，Bodde等[17]认为在制作桡骨缺损模型时, 相邻的尺桡骨骨间膜也应被切除, 以尽可能避免来自骨间膜的影响。骨间膜在维持前臂纵向、横向的稳定, 肘关节屈伸和前臂旋转等功能活动中具有重要作用, 骨间膜的损伤能够在一定程度上影响前臂纵向、横向稳定性[18]。因此, 骨间膜被切除后, 由于稳定性受到影响, 也会增大尺骨所受应力, 也是导致本研究中骨折发生的原因之一。本实验不足之处在于: 为了便于手术的操作及误差控制, 未细化设置11 mm、13 mm、14 mm组别; 由于样本不足, 未能就体质量对骨折发生的影响作进一步深入研究。

综上所述，选择8月龄成年新西兰兔制作桡骨CSD模型时，缺损长度应选择15 mm。但同时应注意由于体质量较大带来的易骨折等并发症。

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