单核细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ条件敲除小鼠的繁殖和基因型鉴定

郑欣洵, 张智静, 黄宝艺, 廖子君, 刘建军, 罗 涛

(1. 北京大学深圳医院, 深圳518035;2. 深圳市第二人民医院, 深圳518035;3. 深圳市疾病预防控制中心, 深圳518000）

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)是调节目的基因表达的核内受体转录因子超家族成员，通过与目的基因增强子位点中的特异性过氧化物酶体增殖物反应元件结合，参与调控脂质代谢、胰岛素敏感性、脂肪酸转运等作用[1]。PPARγ是PPAR亚型之一，除了在脂肪细胞中表达以外，在免疫细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、T细胞以及B细胞均有表达[2,3]。目前研究[4,5]已表明，PPARγ与单核细胞对饮食引起的肥胖、胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受的敏感性有关。此外，PPARγ可抑制单核细胞的炎症反应[6,7]并在多种疾病中发挥抗炎作用[8,9]，而关于单核细胞上PPARγ是具有其它功能及其对应的作用机制尚不明确。

条件性基因敲除(conditional knockout)通过将某种细胞特异性表达cre 重组酶的转基因小鼠和靶基因钳制小鼠杂交，得到在该种特定类型的细胞靶基因特异性敲除的转基因小鼠[10]。由于PPARγ在体内多种细胞上均有表达，因此本课题通过特异性地敲除单核细胞上的PPARγ受体，为进一步研究单核细胞PPARγ受体的功能及其机制提供实验动物。

1 材料与方法

1.1 实验动物

loxp转基因纯合子(PPARγloxp/loxp)小鼠，是在PPARγ基因第1和2外显子的两侧重组添加loxp 位点。两loxp 位点间的序列被删除后将使PPARγ基因发生移码突变; 单核细胞特异性表达cre重组酶纯合子(Cx3cr1cre/cre)小鼠，是在小鼠基因组插入 cre 酶基因，并且该基因可以通过单核细胞特异性的启动子在单核细胞表达 cre 重组酶。与loxp 转基因小鼠杂交，则cre重组酶介导的重组能够将PPARγ基因序列删除，这些序列删除具有细胞特异性，仅在单核细胞中发生。以上小鼠购自美国JAX实验室，小鼠引进后在SPF级实验动物房进行饲养及繁殖 [SYXK(粤)2015-0106]。

1.2 主要实验试剂

他莫昔芬(美国Sigma公司)，基因组DNA提取纯化试剂盒及PCR试剂盒(中国Vazyme公司), 细胞裂解液(中国碧云天公司)，蛋白酶抑制剂(美国MedChemExpress公司), BCA蛋白质定量试剂盒(美国Biosharp公司)，PCR反应引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 单核细胞PPARγ条件性基因敲除小鼠的建立将引进的小鼠按1只雄性(PPARγloxp/loxp)小鼠: 2只雌性(Cx3cr1cre/cre)小鼠合笼，得到F1代，饲养至2～3周时采用RT-PCR方法鉴定小鼠基因型。再由F1代小鼠自交, 采用同样的方法获取F2代并鉴定其基因型, 筛选出基因型为PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre以及PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-小鼠, 为实验所需的PPARγ条件基因敲除小鼠即实验组(PPARγ-ko)，基因型为PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-小鼠为对照组(PPARγ-wt)。

1.3.2 单核细胞PPARγ基因特异性敲除及其鉴定将实验组小鼠饲养至4～6周龄时，连续5 d腹腔注射75 mg/kg他莫昔芬，注射结束后3 d内提取小鼠腹腔巨噬细胞。将获得的腹腔细胞进行培养、分离及纯化，用免疫荧光方法鉴定所提取细胞表型，再用Western blotting方法测定实验组小鼠腹腔巨噬细胞PPARγ蛋白的表达量。

1.3.3 PCR及水平电泳 采用PCR扩增仪(Eppendorf 6347)进行PPARγloxp序列以及Cx3cr1cre序列的循环扩增。引物序列见表1。采用凝胶成像系统(BIORAD)分析条带。

1.3.4 免疫荧光 用质量分数4%多聚甲醛固定实验组小鼠腹腔巨噬细胞，牛白蛋白(BSA)进行封闭后加入Iba1抗体(1∶1000，Wako)进行荧光染色，DAPI封片后用荧光显微镜(Olympus)观察图片、拍照并保存。

表1 转基因小鼠PCR引物序列

1.3.5 Western blotting 用细胞裂解液及蛋白酶抑制剂提取实验组和对照组小鼠腹腔巨噬细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度后，用Western blotting方法测定小鼠腹腔巨噬细胞PPARγ(1∶1000, Abcam)蛋白的表达水平，用全自动化学发光图像分析系统(Tanon)拍照并保存。

2 结果

2.1 F1代及F2代小鼠基因型鉴定

图1是纯合子PPARγloxp小鼠(PPARγloxp/loxp)和单核细胞特异性表达cre重组酶的Cx3cr1-cre小鼠(Cx3cr1cre/cre)杂交产生的F1代分别针对PPARγloxp序列(图1A)和Cx3cr1Cre序列(图1B)得到的条带电泳鉴定结果。由图1A可知, 1～6号小鼠为杂合子, 该小鼠单核细胞PPARγ基因只有一侧插入loxp 序列, 基因型为PPARγloxp/-。图1B结果表明, 1～6号小鼠为杂合子, 基因型为Cx3cr1cre/-。综合以上结果可知, F1代小鼠均为杂合子, 基因型为 PPARγloxp/-Cx3cr1cre/-。

图2是F2代分别针对PPARγloxp序列(图2A)和Cx3cr1Cre序列(图2B)得到的条带电泳鉴定结果。从图2A可知2、4号小鼠为杂合子，该小鼠单核细胞PPARγ基因只有一侧插入loxp 序列，基因型为PPARγloxp/-; 3号为野生型(wt)小鼠，该小鼠单核细胞PPARγ基因两侧无loxp序列插入，基因型为PPARγ-/-, 而1、5号小鼠为突变型且纯合子，基因型为PPARγloxp/loxp, 为实验所需的基因型。由图2B可知1、2号小鼠为杂合子, 基因型为Cx3cr1cre/-，3、4号小鼠为纯合子，基因型为Cx3cr1cre/cre，5号为野生型小鼠，基因型为Cx3cr1-/-。结合图2A及图2B鉴定结果，1号小鼠基因型为PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-，是成功构建的单核细胞PPARγ-ko小鼠，5号小鼠基因型为PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-是实验所需的PPARγ-wt小鼠。

2.2 单核细胞PPARγ基因特异性敲除鉴定

图3A为IBA1标记的腹腔巨噬细胞，图3B为DPAI标记的细胞核，图3C为图3A和图3B的叠合图片，从图可知，所提取的腹腔细胞大部分为IBA1标记的细胞，即为实验所需的巨噬细胞。

由图4可知，实验组小鼠巨噬PPARγ蛋白表达量与对照组小鼠相比明显降低，证明其巨噬细胞PPARγ基因被特异性敲除。

图1 F1子代小鼠全组基因型鉴定图

图2 F2子代小鼠全组基因型鉴定图

序号1～6为小鼠编号; 图1A及图2A分别为F1子代和F2子代针对PPARγloxp序列扩增得到的电泳结果; 图1B及图2B 分别为F1子代和F2子代针对Cx3cr1Cre序列扩增得到的电泳结果

图3 PPAR γ-ko小鼠腹腔细胞表型鉴定

图4 PPAR γ-ko小鼠巨噬细胞PPARγ蛋白表达

3 讨论

条件性基因敲除主要利用噬菌体的 Cre/loxp系统，使目的基因的表达或缺失发生在动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官，获得敲除目的基因的条件性基因敲除小鼠。本实验利用Cre/loxp系统及孟德尔遗传定律构建PPARγ条件基因敲除小鼠。将引进的进口雄性loxp转基因纯合子(PPARγloxp/loxp)小鼠与雌性单核细胞特异性表达cre重组酶纯合子(Cx3cr1cre/cre)小鼠进行杂交, 得到的F1代通过RT-PCR方法鉴定其基因型均为杂合子，基因型为PPARγloxp/-Cx3cr1cre/-(图1)，该鉴定结果与孟德尔遗传定律相符。

将得到的F1代进行自交，理论上产生的F2代基因型有以下9种可能: PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre、PPARγloxp/-Cx3cr1cre/cre、PPARγ-/-Cx3cr1cre/cre、PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-、PPARγloxp/-Cx3cr1cre/-、PPARγ-/-Cx3cr1cre/-、PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-、PPARγloxp/-Cx3cr1-/-、PPARγ-/-Cx3cr1-/-。其中基因型为PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre或者PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-的小鼠其单核细胞PPARγ基因位点两侧插入了方向相同的重组loxp 序列且表达Cx3cr1基因的细胞插入了cre重组酶基因，在雌激素诱导下激活的cre重组酶可识别loxp序列，特异性敲除PPARγ基因, 因此基因型为PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre或者PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-的小鼠即为巨噬细胞PPARγ-ko小鼠; 而基因型为PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-的小鼠其单核细胞PPARγ基因位点两侧虽然均插入了重组的loxp 序列，但是其表达Cx3cr1基因的细胞并无cre重组酶基因的插入，因为，其体内不存在识别loxp序列的酶，即使雌激素诱导下亦无法敲除PPARγ基因，即为PPARγ-wt小鼠。因此, 由图2可知，仅有1号小鼠(PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/-)是成功构建的单核细胞PPARγ-ko小鼠，而5号小鼠(PPARγloxp/loxpCx3cr1-/-)为PPARγ-wt小鼠。

IBA1是小胶质细胞及巨噬细胞的标记物，在成功构建单核细胞PPARγ-ko小鼠后, 根据以往腹腔巨噬细胞分离及培养方法[11,12], 提取小鼠腹腔巨噬细胞, 利用IBA1对所提取腹腔细胞进行标记证实所提取的腹腔细胞大部分为巨噬细胞(图3)。同时利用Western blotting法验证PPARγ-ko小鼠及PPARγ-wt小鼠巨噬细胞PPARγ蛋白表达情况，其结果表明基因型为PPARγloxp/loxpCx3cr1cre/cre或者PPARγloxp/loxp Cx3cr1cre/-的小鼠经他莫昔芬诱导后可特异性敲除小鼠单核细胞PPARγ基因。

基因敲除小鼠是研究基因功能的重要动物模型，通过构建单核细胞PPARγ条件敲除小鼠，就可以在整体动物水平研究PPARγ的作用，进一步地研究单核细胞PPARγ在人体各个脏器相关疾病中发挥的作用及其主要机制，对临床上治疗和预防相关的疾病提供理论依据。

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