多层试验组合策略对1,2-己二醇眼刺激性/腐蚀性的评价

陈秀娟, 黄宇锋, 刘香梅, 庞增雄, 江 漪, 李培宁, 李光先, 陈梓灵, 孙 侠, 王 强

(广州质量监督检测研究院, 广州 511447)

1,2-己二醇(1,2-Hexanediol )是一种多元醇，无色无味, 主要用于化妆品制造、医药制造、食品加工、喷墨制造等行业[1]。1,2-己二醇是一种具有很宽的抗菌广谱性和高活性的原料，目前化妆品制造商正在研究用1,2-己二醇替代苯甲酸类、甲醛类供体和苯氧乙醇类用于化妆品的防腐控制[2,3]。我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)视防腐剂为限用物质，并对防腐剂的种类及使用量作了严格的规定[4], 但1,2-己二醇并未被列入防腐剂的范畴, 也未对其作出安全使用量的说明。因此有必要对1,2-己二醇的安全性进行评价, 为1,2-己二醇在化妆品中的使用提供毒理学数据。近年来基于动物福利及科学技术的进步, 多种替代动物试验的体外方法得到开发和应用[5]。其中牛眼角膜混浊/渗透性试验(bovine corneal opacity and permeability, BCOP)和鸡胚绒毛尿囊膜试验(hen’s egg test - chorioallantoic membrane,HET-CAM) 是目前国内外比较常用的眼刺激性/腐蚀性的体外替代方法。由于每一个替代方法均有其局限性，因此通常采用组合策略, 以实现减少动物试验或完全覆盖动物试验所显示的刺激性范围[5]。本文采用自下而上的组合策略，在符合动物实验“3R”原则基础上对1,2-己二醇是否引起眼刺激性/腐蚀性反应进行安全性评价。

1 材料与方法

1.1 受试物

1,2-己二醇为无色无味透明液体，由广州广曼生物科技有限公司提供，批号为BNB-C301017，纯度为99.87%。使用前用灭菌生理盐水稀释至相应的浓度。阴性对照物采用生理盐水质量分数(0.9%NaCl, NS), 阳性对照物采用无水乙醇及NaOH溶液(0.1 mol/L)。生理盐水购自广东科伦药业有限公司; 无水乙醇购自广州市中南化学试剂有限公司，批号150831，纯度为分析纯; NaOH购自广州化学试剂厂，批号20150401-1，纯度为分析纯。

1.2 实验材料及培养基

SPF级鸡胚由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2014-0002]; 离体牛眼角膜由华代生物科技有限公司提供; 新西兰兔由广州市花都区花东信华实验动物养殖场提供[SCXK(粤)2014-0023]。动物饲养于屏障设施[SYXK(粤)2014-0137]。MEM培养基、Hanks平衡盐溶液均由美国Life Technologies Corporation 公司提供。

1.3 主要仪器

德国BASF公司 Opacitometer Kit3.0型混浊度测量仪; 美国伯乐公司iMARK型酶标仪; 上海一恒科学仪器有限公司LRH250F型生化培养箱; 德国蔡司公司Stemi-2000C型体视显微镜。

1.4 试验方法

1.4.1 自下而上的分层测试组合策略 对不同浓度的1,2-己二醇进行测试，即用HET-CAM试验，鉴别受试物是否为“无刺激性”或“刺激性”; 如结果为“无刺激性”，则无需另外测试，如结果为“刺激性”，再进行BCO P试验，区分“无刺激性”或“刺激性”的浓度范围；依据BCOP试验结果，对“刺激性”的浓度进行体内动物试验，最终确认1,2-己二醇无眼刺激性的最高浓度(试验流程见图1)。

图1 多层试验组合策略

1.4.2 HET-CAM试验 按进出口行业标准SN/T 2329-2009进行操作[6], 用照蛋器选取受精正常且有活力的9日龄鸡胚, 去除气室部位蛋壳，加1～2 mL生理盐水溶液湿润蛋膜，把多余的液体倾出后去除内膜，暴露鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)，通过观察血管系统结构的完整性选择合适的鸡胚用于实验。分别取0.3 mL各浓度的受试物滴加于CAM表面，采用时间评价法(连续模式评分) ，即观察5 min 内CAM 血管变化并记录CAM 血管充血、出血和凝血出现的初始时间(s)，根据观察结果，计算刺激分值(irritation score，IS)(见公式1)。根据进出口行业标准SN/T 2329-2009对HET-CAM实验结果按眼刺激时间评价法的分类标准进行分类(表1)。

式中: secH 出血时间(s); secL 血管融解时间(s);secC凝血时间(s)

表1 HET-CAM试验IS眼刺激时间评价法的分类标准

1.4.3 离体组织型的BCOP试验 参考亚太经济合作与发展组织(OECD) 测试指南437进行操作[8]，分离角膜，用Hanks盐溶液清洗3遍，将角膜固定于角膜挟持器中，加入含体积分数1%胎牛血清的MEM无酚红培养液填满后室和前室，置于32 ℃恒温培养箱中孵育1.5 h后，更换新的培养液，用浊度仪测量角膜浊度本底值，选择合适的角膜用于实验。移除前室中的无酚红MEM培养液, 加入750 μL各浓度的受试物, 暴露染毒10 min。染毒结束后,进行清洗程序, 清洗后用无酚红的MEM培养液充满前房。置32 ℃恒温培养箱孵育2 h后更换无酚红MEM培养液。测量角膜浊度值。测量完毕后前室的无酚红MEM培养液更换为1.0 mL质量分数0.4%荧光素钠溶液，继续培养90 min, 收集后室全部液体, 混匀后用酶标仪在490 nm处测量角膜吸光度(A)值。计算体外刺激评分值(in vitroirritancy score，IVIS) (公式2)。根据OECD 437指南和联合国全球化学品统一分类和标识制度(UN GHS)，对BCOP 眼刺激实验结果进行UN GHS分类(表2)。

表2 BCOP试验IVIS 值与刺激性UN GHS 分类标准

1.4.4 兔眼刺激试验(Draize试验) 依据《化妆品安全技术规范》(2015年版)进行[4]。给予不同浓度的1,2-己二醇后, 于给药后30 s用生理盐水进行冲洗, 观察兔角膜、虹膜和结膜各自在24 h、48 h和72 h的刺激反应, 根据刺激反应积分的均值和恢复时间评价, 按规范所述的分级判定其眼刺激性的强度。

1.4.5 数据统计 采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用±s表示，用单因素方差分析(ANVOA)进行q检验。组间比较用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

CAM与体积分数0.312%～10.00%的1,2-己二醇接触后，在体视显微镜下均观察到出现不同程度的充血、出血和凝血，IS积分随着1,2-己二醇浓度的增加呈上升趋势，详见表3。

2.1 HET-CAM试验

表3 不同浓度的1,2-己二醇HET-CAM试验

2.2 BCOP试验

依据HET-CAM试验结果，对有刺激性的体积分数1.25%～10.00%1,2-己二醇进行BCOP试验。不同浓度的1,2-己二醇与离体牛眼角膜接触10 min，牛角膜混浊度和荧光素纳渗透性均发生不同程度的改变。IVIS分值随着1,2-己二醇浓度的增加而增加，表明1,2-己二醇对眼刺激性/腐蚀性程度有增强的趋势, 体积分数10.00%时有严重腐蚀性(表4)。

2.3 Draize试验

根据IVIS分值, 对有刺激性的体积分数2.50%～10.00% 的1,2-己二醇进行Draize试验，结果体积分数2.50%～5.00%的1,2-己二醇为无刺激性，体积分数10.00%的1,2-己二醇对3只兔的结膜和角膜均造成不同程度的损伤，给药后6 d恢复正常，有轻刺激性(表5)。

3 讨论

正常情况下眼睛很少直接接触外源性化学物，但在化妆品使用过程中，通常由于意外而使化妆品(例如洁面乳、眼部彩妆品等)以稀释的形式进入眼睛产生刺激作用。目前我国的化妆品、农药、消毒产品、化学品等安全性毒理学评价的国家标准中采用传统的兔眼实验，是由Draize等[8]于1944年建立的，一直被认为是评价眼刺激性的金标准。但近年来，在动物福利的压力下，国内外的专家学者正尝试建立代替传统动物实验的体外方法，一些优化的眼刺激性体外试验方法陆续被验证和认可。BCOP、HET-CAM是分别被OECD和欧洲替代方法验证中心(ECVAM)认可、验证的方法，国内学者的研究也已证实BCOP、HET-CAM可用于化妆品、消毒产品等眼刺激性的分类[9-11]。但到目前为止，还没有体外试验可以完全替代Draize试验，体外试验的预测范围也没有完全覆盖Draize试验所反映的损伤和炎症的标准范围。从本文各项体外替代试验可见，在BCOP试验中体积分数10.00%的1,2-己二醇有“严重腐蚀性”，而在动物试验仅显示为“轻刺激性”。BCOP只评估了角膜损伤，因而适于区分到重度眼刺激性物质，对于轻刺激和刺激性物质区分不够敏感[12]。HET-CAM结构与眼结膜相似，通过观察受试物对HET-CAM血管的作用评价受试物的眼刺激性，敖华英等[13]证实该法对于检测中度以下的眼刺激性效果较好，能有效区分无刺激性物质。但HET-CAM试验只模拟了Draize兔试验的结膜反应，未考虑刺激反应的可逆性。鉴于此，考虑到BCOP和HET-CAM试验在实验应用方面具有一定的局限性，为了能在安全的前提下合理利用1,2-己二醇作为防腐体系，本研究在体外试验的基础上，采用少量的动物实验最终确认1,2-己二醇最高无眼刺激性浓度为体积分数5.00%。

表4 不同浓度的1,2-己二醇暴露10 min后BCOP实验

表5 不同浓度的1,2-己二醇Draize试验

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