枯草芽胞杆菌表达牛分支杆菌Mtb8.4抗原摇瓶发酵条件优化

李海涛，张 斌，刘艳环，朱言柱，谷晨晨，闫喜军*，苗利光*

(1.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130112；2.农业部经济动物疫病重点实验室，吉林长春 130112; 3.石家庄市兽用生物制品供应站，河北石家庄 050000)

枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)是一种重要的工业微生物，其遗传学和生理学已得到深入研究[1]。作为宿主菌有利于重组蛋白质的可溶性和分泌性表达，表达产物与胞内蛋白分离，无需细胞破碎，利于蛋白质工程下游的分离和纯化，因此适用于蛋白质分泌性表达的工业化生产[2]。Mtb8.4是从分支杆菌H37Rv株培养滤液中分离纯化出的一种低分子量蛋白抗原，具有细胞免疫活性，能诱导Th1型细胞免疫反应，同时能够产生对感染细胞有强烈溶解能力的特异性CTL、分泌高水平的IFN-γ[3]。

本研究利用已构建的含有pNC-HisE-Mtb8.4质粒的枯草芽胞杆菌分泌表达载体中进行表达制备，对影响表达产率的接种浓度、培养基成分、温度、酸度和发酵培养时长等因素进行优化，得到了一个最优表达条件，为牛分支杆菌Mtb8.4后续开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒 含有pNC-HisE-Mtb8.4质粒的枯草芽胞杆菌由中国农业科学院特产研究所疫病研究室保存。

1.1.2 试剂 胰蛋白胨、酵母提取物 (Oxoid Co.,Ltd.)，大豆蛋白(Becton Dicknson)，埃希氏松鱼提取物(Kyokuto Pharmaceutical Co.,Ltd.)，牛分支杆菌阳性多克隆血清由本实验室制备并保存；分支杆菌Mtb8.4 ELISA试剂盒(上海远慕生物科技有限公司)；其他常规试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.3 培养基 TM培养基(/L)：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，埃希氏松鱼提取物5 g，酵母提取物2 g，FeSO4·7H2O 10 mg，MnSO4·4H2O 10 mg，ZnSO4·7H2O 1 mg，MgCl2·6H2O 4.1 g，调节pH7.0。MT培养基(/L)：在TM培养基中加入MgCl2·6H2O 4.1 g，调节pH7.0。2SY培养基(/L)：葡萄糖20 g，大豆蛋白40 g，酵母提取物5 g，CaCl2·2H2O 0.15 g。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶单因素发酵条件筛选 构建含有pNC-HisE-Mtb8.4质粒的重组枯草芽胞杆菌在含新霉素(Nm 50 μg/mL)、15 g/L琼脂的MT固体平板上划线活化，静置37℃培养过夜，挑取单菌落接入3 mL TMNm液体培养基，30℃～33℃、120 r/min振荡培养36 h，每4 h采样分析菌种生长情况。然后按照一定浓度的接种量转接至发酵培养基中，30℃～33℃、120 r/min振荡培养48 h～72 h，每6 h采样分析菌体生长情况和目的蛋白表达情况。

用摇瓶进行单因素发酵条件筛选，分别对影响目的蛋白产率的TM和2SY培养基、接种浓度、培养温度、表达培养时长各参数进行单因素试验，每个因素设置3个重复，考察各因素的不同水平对菌体生长和蛋白表达的影响。

1.2.2 菌体浓度测定 采集发酵液，用紫外-可见分光光度计于600 nm波长处测量吸光度值(OD600值)。

1.2.3 rBovMtb8.4表达量的测定 采集的样品5 000 r/min离心5 min，取上清，BCA法测量总蛋白表达量，同时用分支杆菌Mtb8.4 ELISA试剂盒检测rBovMtb8.4表达量，操作方法详见使用说明书。

2 结果

2.1 TM和2SY培养基对菌体生长的影响

分别选择TM和2SY培养基，按照4%接种量，设置发酵参数培养温度为30℃、转速120 r/min振荡培养36 h，每6 h采样分析菌体生长情况(图1)，菌体在培养6 h以后迅速生长，12至18 h左右进入快速生长对数期，18 h以后基本稳定，OD600分别为TM培养基4.98和2SY培养基4.67，两种培养基对菌体生长的趋势基本相同，菌体浓度没有明显差异。选择培养时长为18 h对数生长期的菌种为最佳种子阶段。

图1 重组菌在TM和2SY培养基中的生长曲线

TM培养基和2SY培养基对菌体生长和发酵表达量的影响差别不大，由于TM培养基成本明显高于2SY培养基，因此，后续试验均采用2SY培养基为基础发酵培养基。

2.2 接种浓度对菌体生长和发酵表达量的影响

分别选择2%、4%、6%、8%和10%的接种浓度，设置发酵参数培养温度为30℃、转速120 r/min振荡培养48 h～72 h，每6 h采样分析菌体生长情况和目的蛋白表达情况(图2)，接种浓度在6%时菌体生长最佳，浓度OD600为5.31，目的蛋白的表达量为599 mg/L。

2.3 培养温度对菌体生长和发酵表达量的影响

选择不同培养温度，考察温度对菌体生长和表达量的影响，分别设置30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃，按照6%接种浓度，转速120 r/min振荡培养48 h～72 h，每6 h采样分析菌体生长情况和目的蛋白表达情况(图3)，培养温度从30℃～33℃，菌体生长速度呈增长趋势，在33℃时菌体生长达到浓度OD600为6.30，培养温度在34℃、35℃时，菌体生长较之前变缓，可见构建的重组枯草腰包杆菌表达系统在33℃培养最为适宜，重组目的蛋白的表达量也为最高674 mg/L。

图2 接种浓度对重组菌生长和目的蛋白表达量的影响

图3 培养温度对重组菌生长和目的蛋白表达量的影响

2.4 表达培养时长对发酵表达量的影响

按照6%接种浓度，设置发酵参数培养温度为33℃、转速120 r/min振荡培养48 h～72 h，每6 h采样分析菌体生长情况和目的蛋白表达情况(图4)，在培养12 h之后，菌体迅速生长，在18 h～42 h菌体生长旺盛，处于对数生长期，在培养42 h时，菌体浓度OD600达到了6.32，之后菌体浓度不在增加，有比较缓和的下降趋势；从培养30 h开始菌体开始表达重组蛋白，在培养48 h时表达量达到了750 mg/L，随着培养时间的延续，蛋白表达量没有增高。可见，该重组菌的最佳培养时长为48 h。

图4 培养时长对重组菌生长和目的蛋白表达量的影响

3 讨论

枯草芽胞杆菌表达系统比大肠埃希菌表达系统的优势在于表达过程不需要诱导剂，不形成包涵体，不产生内毒素(热源性脂多糖)，能够大量分泌表达胞外蛋白、跨膜后被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，良好的发酵基础和生产技术，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度。

Mtb8.4抗原是一种近年来发现的一种分支杆菌分泌性低分子量蛋白，由于其成熟蛋白分子质量为8.4 ku而得名，具有比较好的生物学活性和免疫学活性[4-5]，可诱导强烈的体液免疫和细胞免疫反应[6]，有很大的开发潜力。但是由于构建的表达系统原因，表达产量相对很低，有研究构建的Mtb8.4大肠埃希菌表达载体，Mtb8.4表达产量为0.6 mg/mL[7]。

通过对以构建的含有pNC-HisE-Mtb8.4质粒的枯草芽胞杆菌分泌表达载体中进行表达制备，对影响表达产率的接种浓度、培养基成分、温度、酸度和发酵培养时长等因素进行了摇瓶发酵表达条件优化，筛选出各单因素的最优摇瓶发酵表达条件：2SY培养基，接种浓度为6%，18 h最佳种子阶段，33℃的培养温度，48 h的培养表达时长，目的蛋白的表达量能够达到750 mg/L。试验结果为后期生产工艺放大提供了有力的数据支持。

参考文献：

[1] 韩佳丽,李 昌,金宁一.枯草芽胞杆菌表达系统的研究进展[D].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册).2009,09，01:247-249.

[2] Tjalsma H,Antelmann H,Jan D H,et al.Proteomics of protein secretion byBacillussubtilisseparating the secrets of the secretome[J].Microbiol Mol Biol Rev,2004,68(2):207-233.

[3] van Dijl J M,Hecker M.Bacillussubtilis:from soil bacterium to super-secreting cell factory[J].Microbial Cell Factories,2013,12(3),doi:10.1186/1475-2859-12-3.

[4] 李海涛，苗利光，刘艳环,等.牛分枝杆菌ESAT-6/Ag85B/Mtb8.4基因与牛IL-2基因融合表达[J].畜牧与兽医,2010，42(6):67-70.

[5] Sana K,Madeeha A,Ruqqya K,et al.Potential of multi-component antigens for tuberculosis diagnosis[J].Biologicals,2017,48:109-113.

[6] Xun L,Zejiao D,Yue W,et al.A novel liposome adjuvant DPC mediatesMycobacteriumtuberculosissubunit vaccine well to induce cell-mediated immunity and high protective efficacy in mice[J].Vaccine,2016,34(11):1370-1378.

[7] 刘万波.结核亚单位疫苗Mtb8.4-HspX和HspX-Mtb8.4表达纯化及免疫效果研究[D].甘肃省兰州市，兰州大学，2012.