EB病毒LMP1 C端重组蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

毛珊珊，王路得，周萌，吕开绩，朱进顺，Kamara Saidu，叶晓鲜，张丽芳

（温州医科大学 分子病毒与免疫研究所 病原生物与免疫学系，浙江 温州 325035）

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）属于人类γ疱疹病毒科，广泛存在于人群中，且主要以潜伏感染的形式存在。EBV感染与某些肿瘤的发生和发展密切相关，如伯基特淋巴瘤（Burkitt’s lymphoma，BL）、霍奇金病（Hodgkin’s lymphoma，HL）、鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）等[1]，且与某些自身免疫性疾病的发病也密切相关，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）[2]。EBV在潜伏感染的过程中表达3种潜伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP），包括LMP1、LMP2A和LMP2B。其中，LMP1为66 kDa的跨膜蛋白，是由386个氨基酸组成的功能蛋白，在细胞膜上可形成多次跨膜，其N端的1～23和C端的187～386均游离于胞浆区，具有生物学意义[3]。EBV LMP1的N端在维持B细胞激活、转化及免疫调节上起作用，而胞

浆区的187～386段，即EBV LMP1 C端，是LMP1的功能区域，在EBV诱导细胞发生转化的过程中发挥着重要作用。本研究选取了C端的200个氨基酸（187～386）作为研究对象，通过原核表达的方式制备了EBV LMP1 C端重组蛋白及其兔多克隆抗体，并检验其生物学特性。

1 材料和方法

1.1 材料E.coliBL21（DE3）感受态细菌购自美国Invitrogen公司；鼻咽癌细胞株C666-1、CNE-2Z、人黑色素瘤细胞株A375均由本实验室保存；1 kb DNA marker、DL2000 DNA marker、限制性内切酶NdeI和XhoI购自美国NEB公司；镍螯合亲和层析胶（Ni-NTA Agarose）购自德国Qiagen公司；异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）购自上海杰瑞生物有限公司；His-tag单克隆鼠源抗体、HRP Goat anti-Mouse IgG（H+L）抗体、HRP Goat anti-Rabbit IgG（H+L）抗体、ECL化学发光液均购自杭州联科生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重组质粒构建及测序分析：对LMP1 C端进行密码子优化，送杭州擎科梓熙生物公司全基因合成，将公司合成的LMP1 C端基因构建到pET21a（+）载体，并转入E.coliBL21（DE3）感受态细菌中，挑取单个的菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，提取的质粒进行酶切和测序鉴定。

1.2.2 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重组蛋白表达、纯化及鉴定：将测序正确的阳性质粒转化E.coliBL21（DE3）感受态细菌中，接种于LB液体培养基中，37 ℃，250 r/min培养至菌液OD600=0.6～0.8；加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，250 r/min，37 ℃恒温振荡培养6 h；利用高速离心机收集菌液；PBS溶解后超声裂解细菌，并12000 r/min离心10 min，收集上清；经镍螯合亲和层析胶纯化重组蛋白，收集得到LMP1 C端重组蛋白；经SDS-PAGE分析；用His-Tag mAb为一抗，HRP Goat anti-Mouse IgG（H+L）为二抗，进行Western blot分析和鉴定。

1.2.3 EBV LMP1 C端兔多克隆抗体的制备：取4只白兔随机分为2组，用于免疫EBV LMP1 C端蛋白和PBS；免疫蛋白前，对大耳白兔于耳缘静脉采血，将样品作为0周对照组；以500 μg/只的量于第1、第3、第5周依次进行背部皮下多点注射；初次免疫EBV LMP1 C端重组蛋白与完全弗氏佐剂以1∶1（V∶V）的比例混合乳化，第2、第3次免疫时换为不完全弗氏佐剂，并在第2、第4、第6周耳缘静脉取血；第8周进行心脏取血，37 ℃水浴1 h后于预冷的超速离心机中，4 ℃，4000 r/min离心20 min，收集上层血清，低温保存备用。

1.2.4 EBV LMP1 C端兔多克隆抗体与重组蛋白结合的特异性检测：LMP1 C端蛋白经SDS-PAGE后转膜，用一抗稀释液以1∶5000稀释兔多克隆抗体，HRP标

记的山羊抗兔二抗进行免疫印迹反应，ECL显色。

1.2.5 EBV LMP1 C端兔多克隆抗体反应及效价检测：用包被缓冲液稀释LMP1 C端蛋白，以终浓度10 μg/mL包被ELISA板，PBS免疫血清作为对照组；0.3 g/mL脱脂牛奶封闭；0、2、4、6、8周兔血清作为一抗；1∶10000稀释的HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）为二抗；TMB显色，H2SO4终止；酶标仪读

取450～630 nm处吸光值读数。用ELISA方法检测

免疫8周后血清抗体效价，将8周血清分别倍比稀为1∶40、1∶160、1∶640、1∶2560、1∶10240、1∶40960、1∶163840、1∶655360，所有血清标本均重复3孔，读取450～630 nm处吸光值读数。

1.2.6 EBV LMP1 C端兔多克隆抗体特异性识别天然EBV LMP1蛋白：将C666-1、CNE-2Z、A375细胞以104个/孔接种于细胞爬片上，置于4%多聚甲醛37 ℃固定10 min；0.3% triton x-10037 ℃孵育10 min；PBST洗3次，置于摇床上清洗，每次3 min；用5%山羊血清，置于37 ℃封闭90 min。取出6孔板，加入PBST，每孔2 mL，于摇床上清洗3 min；加入兔抗EBV C端蛋白多克隆抗体（1∶5000稀释），4 ℃孵育过夜；PBST洗3次；用FITC标记的羊抗兔二抗IgG（H+L）（1∶2000），避光37 ℃孵育1 h；PBST洗3次；避光加入RNA酶（1∶100）和PI（1∶1000）避光染色5 min；避光PBST洗3次；显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重组质粒的鉴定

用NdeI和XhoI限制性内切酶对重组质粒pET21a（+）/EBV LMP1 C端进行酶切，得到一条约600 bp的条带（见图1）；选取阳性菌株送公司测序分析，经Blast比对，重组序列与目的片段完全一致。

2.2 pET21a（+）/EBV LMP1 C端重组质粒的原核表达、纯化及鉴定 培养含有pET21a（+）/EBV LMP1 C端重组质粒的BL21（DE3）大肠杆菌，收集加入和未加入IPTG诱导表达的样品及纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析，在27 kDa处出现单一的蛋白条带（见图2A）。His-Tag mAb抗为一抗（1∶10000）进行Western blot分析，在27 kDa处可见阳性反应条带（见图2B）。

1：1 kb DNA marker；2：pET21（+）；3：pET21a（+）/EBV LMP1 C端+Nde I；4：pET21a（+）/EBV LMP1 C端+Nde I+Xho I；5：DL 2000 DNA marker

图2 EBV LMP1 C端蛋白表达及纯化的SDS-PAGE电泳（A）和Western blot分析（B）

2.3 EBV LMP1 C端特异性兔多克隆抗体反应及效价 采用ELISA方法对以重组蛋白LMP1 C端为抗原得到的兔血清抗体进行检测。重组蛋白包被酶标板，0、2、4、6、8周兔多克隆抗体作为一抗，结果显示，LMP1 C端重组蛋白免疫的白兔在第2周开始产生特异性抗体，至第8周达到高峰（见图3A）。取8周时血清做抗体稀释滴度检测，结果显示，LMP1 C端兔多克隆抗体的效价可达1∶40000（见图3B）。

图3 EBV LMP1 C端重组蛋白免疫兔血清抗体反应（A）及效价分析（B）

2.4 EBV LMP1 C端兔多克隆抗体特异性结合重组蛋白的检测 利用Western blot方法对获得的兔多克隆抗体与LMP1 C端蛋白结合和识别的特异性进行检测分析，以第8周兔多克隆抗体为一抗（1∶5000），在相对分子质量27 kDa处可见特异性阳性条带（见图4）。

图4 兔血清EBV LMP1 C端Western blot分析

2.5 EBV LMP1 C端兔多克隆抗体特异性识别天然EBV LMP1蛋白 选择EBV LMP1表达阳性的鼻咽癌细胞C666-1、CNE-2Z细胞株作为实验组，同时选取LMP1表达阴性的人黑色素瘤细胞株A375作为对照组，用以检测EBV LMP1 C端蛋白多克隆抗体与鼻咽癌肿瘤细胞中天然表达的LMP1特异性识别和结合的能力。结果显示，EBV LMP1 C端多克隆抗体能够在C666-1和CNE-2Z的胞浆中，与LMP1特异性结合，表现为数个团块状绿色荧光，而A375细胞中未见明显的绿色荧光（见图5）。结果表明，EBV LMP1 C端蛋白兔多克隆抗体能够特异性识别细胞中天然表达的LMP1蛋白。

3 讨论

图5 LMP1 C端兔血清多克隆抗体特异性免疫荧光鉴定（×400）

EBV LMP1 C端是游离于胞浆区的200个氨基酸，含有3个功能结构域，即C末端活化区域（C-termina1 activation region，CTAR）1、CTAR2和CTAR3，这3个结构域提供了信号分子对接蛋白的结合位点，如TNFR相关因子（TNFR-associated factors，TRAFs）、TNFR相关死亡结构域（TNFR-associated death domain，TRADD）、受体相互作用蛋白激酶（receptor interacting protein kinase，RIP）和BS69等，通过NF-κB、p38-MAPK、PI3-K/Akt、ERKMAPK和JAK/STAT等信号通路转导细胞信号[4-7]。从而产生促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、增强细胞迁移等多种生物学作用[8-9]。如C端功能区的CTRA1和CTAR2可直接与TNFRs蛋白或TRADD结合，从而激活NF-κB的活性，促进细胞增生[10-11]；CTAR3通过募集JAK3，进而活化STAT3[12]。因此，EBV LMP1 C端的187～386氨基酸序列在EBV诱导细胞转化和癌变过程中发挥重要作用。

通过原核表达制备靶蛋白，是研究靶蛋白生物学作用的重要途径之一。目前研究表明，EBV LMP1可通过原核表达制备重组蛋白，对其生物学功能进行研究，用于原核表达的载体主要包括pET32a载体和PGEM-T载体[13-15]，但这些载体表达的融合蛋白携带有载体本身蛋白，而载体蛋白对实验结果会产生一定的干扰作用。为此，本研究设计了起始密码子后的第1个密码子即为目的蛋白翻译的起始密码子，利用pET21a载体系统获得的蛋白即为全长目的蛋白，即LMP1 C端蛋白，从而避免了载体成分对实验结果的影响。经过免疫日本大耳白兔制备的抗体具有效价高的特点，利用Western blot和免疫荧光分析，该蛋白可特异性识别EBV LMP1蛋白，表明本研究制备的EBV LMP1 C末端蛋白具有较强的免疫原性和抗原性。

目前，商业化的EBV LMP1单克隆抗体主要有下列几种，即能识别位于LMP1 C端的多个抗原表位的单克隆抗体混合而成的抗体（CS1、CS2、CS3、CS4），可识别20种地理位置上不同的EBV分离株（CS 1～4）及可识别EBV LMP1 C末端Asp293-Asp312位点的单克隆抗体（D24-G）。但上述单克隆抗体仍然有一些问题存在，如针对的抗原表位有限且成本昂贵。多克隆抗体则由于识别谱广，制备简单方便，且经济实惠，在免疫学检测及实验中具有较为广泛的应用前景。本研究通过LMP1 C端蛋白制备的兔多克隆抗体，可特异性识别LMP1的C末端，且效价高，特异性强，可为EBV LMP1的基础研究和临床应用提供依据。

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