血清miR—499a—3p在不稳定型心绞痛中的表达

陈英 曾志羽 郑慧蕾 文宏 龚丹萍

【摘 要】目的：检测miR-499a-3p在不稳定型心绞痛（Unstable angina，UA）与疑似心绞痛非冠心病患者血清中的表达差异。方法：收集实验组UA患者（n=30）及对照组疑似心绞痛的非冠心病患者（n=21）外周血。利用HiPure Serum/Plasma miRNA Kit分离方法，获取血清中总RNA。Real-Time PCR检测两组血清miR-499a-3p表达量。结果：通过相对定量分析2-△△Ct法算出两组miR-499a-3p的相对表达量，使用SPSS统计学软件分析，与对照组相比较，UA组血清miR-499a-3p的表达量明显升高（P<0.05）。结论：实验组较对照组血清miR-499a-3p的表达水平增高，可为UA的有效检测指标提供新的策略。

【关键词】UA； miR-499a-3p； cel-mir-39

【中图分类号】R395.3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）04-00-02

前言

CHD包括隐匿型或无症状性冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病、猝死五型。曾有多项研究表明，miR-499在心肌细胞中富集，当发生急性心肌梗死时，血清miR-499呈现高表达状态[1-3]。冠脉不稳定斑块破裂是急性心肌梗死的常见原因。目前国内外关于UA循环miRNA的研究相对较少，UA缺乏快速、有效的检测指标，所以探索UA患者循环miRNA表达差异意义重大。本文旨在探究miR-499a-3p与UA的关系，为血清miR-499a-3p作为早期诊断UA的潜在生物标记物提供依据，避免因冠脉不稳定斑块破裂、糜烂基础上继发血栓形成导致冠状动脉持续、完全闭塞。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：血清miRNA提取试剂盒、miRNA第一链cDNA合成、通用型SYBR GREEN I定量PCR试剂盒、焦磷酸二乙酯（DEPC）、Rnase free water。

1.1.2. 耗材：一次性吸头、0.2ml平盖磨砂PCR管、1.5mlEP管、0.2ml平盖透明八联PCR管。

1.1.3 仪器： 颗粒制冰机、高速冷冻离心机、快速震荡混匀器、PCR仪、定量PCR仪。

1.1.4.实验对象：30名患者冠脉造影证实血管狭窄≥50%，同时满足2012年不稳定心绞痛（UA）/非ST段抬高心肌梗死（NSTEMI）患者管理指南作为实验组。21名患者因心前区或胸骨后疼痛行冠脉造影且结果为阴性作为对照组。

2 方法

2.1 血清的收集和储存：将采取的5ml外周静脉血样收集在促凝管中并在4℃下静置10分钟。将样品在4℃以2500r/min离心5分钟以获得上清液。用移液枪取1ml血清加入到1.5ml离心管，最后放入-80℃低温冰箱保存直至使用。

2.2 血清miRNA 提取：取500ul的血清，加入25fmol/μl的cel-mir-39外参照（购自ABI公司）10μl后，按照说明书提取miRNA，总RNA（含小分子RNA）样品保存-80?C冰箱。

2.3 茎环法逆转录：逆转录引物序列为：cel-miR-39：

5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcaagct -3miR-499a-3p：

5- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACagcaca -3

逆轉录步骤和体系按说明书进行。

2.4 荧光定量PCR：cel-miR-39上游引物GGCCTCACCGGGTGTAAATCAG；miR-499a-3p上游引物GGCCAACATCACAGCAAGTCTG；通用下游引物AGTGCAGGGTCCGAGGTAT。反应体系：Mix10ul；上/下游引物0.6ul； cDNA1ul；双蒸水7.8ul。反应条件：95℃ 10min； 95℃ 15s； 60℃ 1min反应结束后，按仪器默认条件40个循环、60℃收集荧光。样本相对表达量的计算：按以上体系以及条件分别测定待测样本目的基因及外参的Ct值。2-△△Ct法计算基因表达的差异。

2.5 统计学分析：采用spss25.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差 （）表示，两组间采用两独立样本t检验；计数资料组间采用2检验；若p<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

不稳定型心绞痛患者血清miR-499a-3p表达水平

3.1 两组miR-499a-3p相对表达量和年龄情况

3.2 两组性别、民族、高血压、糖尿病、血脂异常情况

上表进行组间四格表卡方检验： 2性别 =0.264，P=0.607；2民族=2.596，P=0.107；2高血压=1.244，P=0.265；2糖尿病=0.400，P=0.527；2血脂异常=0.415，P=0.520。结合1、2可以看出血清miR-499a-3p在两组患者表达存在差异，差异有统计学意义（P<0.05）；而性别、年龄、民族、高血压、糖尿病、血脂异常进行统计分析，差异均无统计学意义（P>0.05）。

4 讨论

UA是CHD的一种常见类型；弥漫性动脉粥样硬化导致严重的胸痛，持续时间较长，易于恶化为急性心肌梗死（AMI）或猝死[4]。目前临床上缺乏快速、有效的生物标志物。近年来，miRNA作为生物标志物的研究已成为热点。

循环mirRNA是具有内源性核糖核酸酶活性的短RNA并在人体血清内呈稳定形式存在[5]。miRNA是一组长度为21-25个核苷酸组成的小型非编码RNA[6]。几项研究强调了循环miRNA作为急性冠脉综合征（ACS）诊断和预后生物标志物的潜力[7-10]。miRNA表达谱分析研究表明特定的miRNA在患病心脏中的表达水平发生变化，表明它们参与了心肌病[11，12]。基于miRNA的组织选择性，心肌细胞富含miRNA（诸如miR-1，miR208a，miR-208b，miR-133a），并已经提出miR-133b和miR-499作为急性心肌梗死患者潜在的诊断标志物[13-15]。

與cTnI和CK-MB相比，miR-499早在胸痛发作后1小时就存在于血浆中，甚至在胸痛发作后9小时仍继续增加，而CK-MB和cTnI需要在胸痛2小时后才能检测到，表明 miR-499水平可用于早期检测AMI，这支持了miR-499可能作为AMI的早期生物标志物的证据[3]。以上发现为血清miRNA-499a-3p作为潜在生物标志物用于辅助诊断 UA提供了实验依据。

本研究发现UA组血清miRNA-499a-3p 升高，这是支持血清miRNA-499a-3p作为UA的早期生物标志物的证据，能够早期诊断UA加以药物、手术等干预措施，减少UA进一步发展为AMI。但是考虑到样本量不是十分充足，血清miRNA-499a-3p作为潜在生物标志物用于UA临床诊断的价值尚需进一步研究。

综上所述，本研究分析不稳定型心绞痛与疑似心绞痛的非冠心病患者血清miR-499a-3p的表达差异，为血清miR-499a-3p作为潜在生物标志物用于临床辅助诊断UA提供了一种新的策略。

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