小粒径辛伐他汀盘状重组高密度脂蛋白载药系统的制备及体外评价

杨芸 张文丽 刘建平

【摘 要】目的：体外制备小粒径辛伐他汀盘状重组高密度脂蛋白载药系统，对其理化性质进行表征并观察载药系统对泡沫细胞存活率的影响。方法：利用乙醇注入-超声分散法制备辛伐他汀脂质体，借助胆酸钠介导载脂蛋白apoA-I与脂质结合，构建盘状重组高密度脂蛋白载药系统。对载药系统的理化性质进行表征，并进行MTT实验测定泡沫细胞存活率。结果：载药系统为40 nm左右的盘状，长轴方向上的直径在100 ～ 200 nm，盘的侧面高度在50 nm以下。药物包封率在80 %以上，载药量约为2.8 %，在4℃放置7天内稳定性良好。apoA-I与脂质结合后其α-螺旋含量上升，与脂质结合的稳定性有所提高。载药系统与泡沫细胞孵育后，细胞存活率有所升高。结论：体外成功制备了小粒径辛伐他汀盘状重组高密度脂蛋白载药系统，该系统对泡沫细胞的病理凋亡具有一定的治疗作用。

【关键词】 盘状重组高密度脂蛋白；辛伐他汀；载脂蛋白apoA-I；泡沫细胞

【中图分类号】R743 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2018）04-00-01

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种动脉壁的慢性炎症疾病，与冠状动脉疾病、心肌梗塞等多种血管疾病的发生有关[1]。巨噬细胞存在于AS的各个病理阶段，参与斑块炎症反应、纤维帽变薄、坏死核心形成及斑块破裂等多个病理过程[2，3]。因此，将巨噬细胞作为治疗AS的靶点具有重要的研究意义。

高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）是一种存在于血浆中的天然脂蛋白，直径在7～13 nm，由多种生物大分子组成[4，5]。载脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I，apoA-I）是HDL上含量最为丰富的蛋白成分，约占HDL蛋白含量的70 %。此外HDL上还包括一些其他的脂质成分，如胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯以及磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂等多种磷脂。HDL能够移除外周组织多余的胆固醇，递送肝脏进行代谢消除，这一过程即为胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）[5，6]，RCT被认为是HDL抗AS的主要机制[4]。此外，HDL还具有抗炎、抗氧化等多种生理功能[7]，同样能够起到抗AS的治疗作用。

目前，国内外已有学者体外制备重组HDL（reconstituted HDL，rHDL），具有与天然HDL相类似的组成、性质及结构，并具有良好的生物相容性、生物可降解性等优势，可将其作为化药[8]、基因[9]或造影剂[10]的载体。他汀类药物具有降血脂、抗炎抗氧化等藥理效用，可用于抗AS。口服治疗剂量的他汀类药物主要在肝脏发挥降脂作用，若要达到抑制斑块的作用，则需要口服5 ～ 7倍的剂量[11]，如此会产生一定的肝毒性并伴随有肌病等一系列副作用。因此，将脂溶性他汀类药物载入rHDL中，可降低毒副作用，同时实现药物与载体抗AS的协同作用。

本实验室前期采用薄膜分散法制备载他汀类药物的rHDL[12]，该方法中使用的氯仿具有高毒性。本文以辛伐他汀（simvastatin，ST）作为模型药，采用乙醇注入-超声分散法制备辛伐他汀脂质体（ST loaded liposome，ST-liposome），避免采用高毒性有机溶剂，此外制备过程中不加入胆固醇，以尽量减少促AS发展的不良因素的引入。将脂质体与apoA-I蛋白样品孵育，得到小粒径辛伐他汀重组高密度脂蛋白载药系统（ST-loaded rHDL，ST-rHDL）。对制备得到的载药系统进行粒径、包封率（entrapment efficiency，EE）及载药量（drug-loading rate，DL）测定，以透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）观察其形态特征，并利用圆二色光谱（circular dichroism，CD）及盐酸胍（guanidine hydrochloride，Gdn-HCl）变性实验研究apoA-I的二级结构及其与脂质结合的稳定性，最后观察ST-rHDL对RAW 264.7巨噬细胞源性泡沫细胞存活率的影响。

1 实验材料

1.1 试剂 大豆磷脂（上海艾韦特医药科技有限公司）；辛伐他汀原料药（上虞京新药业有限公司惠赠）；胆酸钠（北京索莱宝科技有限公司）；Tris（生兴生物公司）；Sephadex G50（50-150 μm，瑞典pharmacia公司）；apoA-I蛋白样品（实验室从FIV沉淀中提取）；DMEM细胞培养基（维森特生物技术有限公司）；胎牛血清FBS（维森特生物技术有限公司）；四甲基噻唑蓝MTT（sigma）；ox-LDL（广州奕源生物科技有限公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为市售分析纯

1.2 仪器 JY-92II超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RE-85Z旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器厂）；动态光散射仪（Brookhaven）；RF-5301PC荧光分光光度计（岛津）；高效液相色谱仪（岛津）；紫外分光光度计（南京科尔仪器设备有限公司）；J810圆二色光谱仪；透射电镜（Hitachi）；原子力显微镜（VEECO）

1.3 细胞 RAW 264.7巨噬细胞（南医大惠赠）

2 实验方法

2.1 药物含量测定方法的建立

2.1.1 HPLC方法的建立 对一定浓度的ST-甲醇溶液在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，确定药物的检测波长为238 nm。色谱柱：Kromasil ODS C18柱（5 ?m，250 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇：水（78：22，v/v）；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：50 μl。

2.1.2 HPLC方法专属性 将一定浓度的ST-甲醇溶液及用甲醇破乳稀释的空白rHDL载体分别进行HPLC检测。

2.1.3 标准曲线的建立 用甲醇配制浓度分别为0.5、1、2、10、20、50、100 μg/ml的ST标准溶液，进行HPLC检测，以峰面积对ST浓度作图得到标准曲线。

2.1.4 回收率及精密度考察 用甲醇配制浓度分别为0.5、10和100 μg/ml的ST标准溶液，加入一定体积的空白rHDL载体，进行HPLC检测，计算回收率及RSD值。取回收率所用样品溶液，于一天内三个不同时间及连续三天的同一时间进样，得到日内、日间精密度并计算RSD值。

2.2 ST-rHDL的制备 称取处方量的大豆磷脂和ST放入西林瓶中，无水乙醇溶解，此为有机相。另取一定体积Tris-HCl缓冲液（含胆酸钠）于另一西林瓶中作为水相。将有机相加热至65℃，匀速缓慢滴入相同温度下持续搅拌的水相中。滴加结束后继续保温搅拌1 h，超声分散后旋转蒸发除去乙醇，用缓冲液定容至适当体积后过滤得到ST-liposome混悬液。将混悬液与apoA-I蛋白样品室温孵育，过滤即得ST-rHDL。

2.3 ST-rHDL的理化性质表征 2.3.1 粒径测定

将ST-liposome及ST-rHDL稀释一定倍数后，利用动态光散射法（dynamic light scattering，DLS）测定粒径及多分散指数（polydispersity index，PDI）。

2.3.2 EE及DL测定 用葡聚糖微柱离心法分离ST-rHDL和游离药物，进行HPLC检测并计算药物浓度。取相同体积的ST-rHDL直接用甲醇破乳稀释，进行HPLC检测并计算药物浓度。按下述公式（1）计算EE：EE （%）= C/C0 × 100 % （1）式中，EE为药物的包封率；C为rHDL中包裹的药物浓度；C0为rHDL混悬液中的药物总浓度。

按下述公式（2）计算DL：DL （%）= W/W0 × 100 % （2）式中，DL为载药量；W为rHDL中包裹的药物总量；W0为ST-rHDL的药物和辅料的总重量。

2.3.3 TEM形态观察 将ST-liposome及ST-rHDL稀释后滴到碳膜覆盖的铜网上，用磷钨酸溶液（2.0%，w/v）于室温下染色样品，烘干后进行TEM观察。

2.3.4 AFM形态观察 将ST-rHDL稀释后滴于1 cm × 1 cm的玻璃片上，烘干后进行AFM观察。

2.3.5 apoA-I的二级结构检測 将apoA-I蛋白样品及ST-rHDL进行透析，除掉盐分。以去离子水作为空白背景，检测190 ～ 250 nm波长范围内的CD光谱。用蛋白二级结构预测软件计算α-螺旋，β-折叠，β-转角和无规卷曲所占百分比。

2.3.6 apoA-I与脂质结合的稳定性考察 配制一系列浓度的Gdn-HCl溶液，与等体积ST-rHDL或apoA-I蛋白样品溶液混合，使得Gdn-HCl浓度分别为0、1、2、4、5、6、8、10、12 M，24 h后用荧光分光光度计测定最大荧光发射波长，固定激发波长为280 nm。

2.3.7 放置稳定性考察 将ST-rHDL置于4 ℃储存，分别于1、4、7天后，测定其粒径及EE。

2.4 泡沫细胞存活率检测 取对数生长期的RAW 264.7细胞以5000个细胞/孔的密度接种于96孔板，以含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM细胞培养基于5 % CO2，37 ℃培养箱中培养细胞贴壁，以60 μg/ml的ox-LDL继续培养24 h以诱导细胞泡沫化。PBS清洗后，加入无血清培养基稀释的ST-rHDL（磷脂浓度分别为50、100、200、400、600和800 μg/ml），37 ℃孵育6 h。PBS清洗后，加入含 MTT的无血清培养基，37 ℃孵育4 h。移除培养液，加入DMSO溶解蓝紫色甲瓒结晶，用酶标仪于570 nm测OD值。此外，设计一组泡沫细胞以不含ST-rHDL的无血清培养基培养6 h观察存活情况。每个样品六复孔，根据下式计算细胞存活率：

其中，ODcontrol为仅用空白培养液不加药处理的含细胞的对照孔的OD值，ODs 为加药处理的供试孔的OD值，OD0 为无细胞的空白孔的OD值。

3 结果和讨论

3.1 药物含量测定方法的建立

3.1.1 HPLC方法专属性

如图1所示，药物出峰时间在13 ～ 14 min，辅料对药物的检测没有干扰，该方法专属性良好。

3.1.2 标准曲线的建立

标准曲线方程为：Peak area=-65589.25726 + 99935.36131×C，R2 = 0.9999。ST浓度在0.5 ～ 100 μg/ml范围内峰面积与浓度成正比，线性关系良好。

3.1.3 回收率及精密度考察

在低、中、高三种浓度下的回收率均在98～102%之间，RSD值均小于2%，且三种浓度下的日内、日间精密度的RSD值均小于2%，符合方法学要求。

3.2 ST-rHDL的理化性质表征

3.2.1 粒径测定

结果如表1所示，ST-liposome粒径约为40 nm，孵育apoA-I蛋白样品形成ST-rHDL之后，其粒径没有发生明显改变，粒径仍在40 nm左右。

3.2.2 EE及DL测定

以相同处方工艺条件制备三批ST-rHDL经葡聚糖凝胶微柱离心法分离载体与游离药物并进行HPLC检测，计算得到的 EE为（85.09 ± 0.57）%，DL为（2.80 ± 0.02）%。

3.2.3 TEM形态观察

圖3 （A）ST-liposome，形态为不规则的球形，原因可能是脂质材料中不含胆固醇，因此磷脂双层膜的流动性较强，容易变形。图3（B）为ST-rHDL，明显看出载体呈盘状，且堆积在一起。TEM比例尺为200nm，可见粒径平均在40nm左右，与DLS检测结果一致。

3.2.4 AFM形态观察

如图4所示，ST-rHDL形态为盘形，长轴方向的直径在100～200 nm之间，盘的侧面高度小于50 nm。

3.2.4 apoA-I的二级结构检测

根据CD谱图预测得到的二级结构各百分含量如表2所示，游离apoA-I与rHDL的脂质结合之后，构象发生了一定改变，各二级结构所占百分比含量都发生了不同程度的变化。如α-螺旋含量升高，一定程度上能够促进蛋白与脂质之间的结合[13]。

3.2.5 apoA-I与脂质结合的稳定性考察

如图5所示，将游离apoA-I与不同浓度的Gdn-HCl溶液孵育相同时间后，其最大荧光发射波长有所改变。随着Gdn-HCl溶液浓度增大，游离apoA-I的最大荧光发射波长逐渐增大，说明apoA-I在Gdn-HCl作用下发生变性，构象发生明显改变。相比之下，apoA-I与脂质结合后，其稳定性有所提高，耐受Gdn-HCl的能力增强。

3.2.6 放置稳定性

将ST-rHDL于4 ℃放置7天，期间制剂粒径及EE均未发生明显改变，放置稳定性良好。

3.3 泡沫细胞存活率检测

不同浓度载药制剂对泡沫细胞存活率的影响如图6所示，泡沫细胞存活率均大于100%。泡沫细胞不加制剂同样培养6 h后的细胞存活率以培养0 h为对照，结果显示，泡沫细胞本身活性会下降，存活率降至60%。因此，载药制剂对泡沫细胞起到了一定的治疗作用，如介导胆固醇外流、制剂摄取进入细胞以使药物发挥作用等，使得细胞泡沫化程度有所缓解，存活情况改善。但制剂浓度过大时，由于高的脂质浓度，本身会有一定细胞毒性。

4 结论

本文利用乙醇注入-超声分散法制备了不含胆固醇的辛伐他汀脂质体，避免使用高毒性有机溶剂，同时减少了不利于抗AS的成分的引入，借助胆酸钠介导载脂蛋白与脂质结合，构建小粒径盘状重组高密度脂蛋白载药系统，该系统对泡沫细胞的病理凋亡具有一定的缓解作用，提高细胞存活率。该载药系统粒径相对较小，有利于体内靶向递送时穿透斑块组织表面的纤维帽结构，到达深层泡沫细胞发挥治疗作用，为后续载体的进一步优化设计及体内靶向研究提供了一定的研究基础。

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