真空厌氧间歇技术富集福鼎大白茶茶鲜叶GABA的参数优化

沈 强,许凡凡,张小琴,潘 科,刘忠英,郑文佳,*

(1.贵州省农业科学院茶叶研究所,贵州贵阳 550006; 2.贵州民族大学人文科技学院,贵州贵阳 550025)

GABA(γ-氨基丁酸)是一种四碳非蛋白质组成的天然氨基酸,广泛存在于动、植物及微生物中[1-3],在人体中具有降血压、改善和治疗糖尿病、抗癌功能、抗疲劳功能、改善脑功能,增强记忆力、调节激素分泌及控制哮喘病等众多生理功能[4]。茶叶中也存在极少量的GABA,如绿、红、青茶中仅含约0.01%～0.02%[5],研究表明,茶鲜叶在经过厌氧[6]、喷施叶面肥[7]、浸泡处理[8-9]、微生物发酵[10]及微波照射[11]等特殊技术处理后能够积累大量的GABA,其中最为常用的是厌氧技术,常将CO2、N2、真空和间歇厌氧等处理作为茶叶中的厌氧处理条件。最早,日本津志田藤二郎[6]发现茶鲜叶在经过连续6 h充氮除氧处理后能积累大量的GABA,并以一种GABA含量在1.50 mg/g以上的新型降压茶推向市场;此后,泽井佑典[12]发现采用间歇厌氧处理要比连续厌氧富集效果好。在我国,林智[13]发现将真空作为厌氧条件的处理效果要显著优于氮气处理,郝强等[14-15]对真空处理设备进行了探索研究,结果证明采用此设备处理云南大叶茶种鲜叶后其GABA含量超过标准1.2倍以上。厌氧环境下,茶鲜叶中的谷氨酸脱羧酶(GAD)被激活,促进GAD催化L-谷氨酸(L-Glu)脱羧反应,生成大量的GABA。研究表明,氨基酸含量高或GAD(谷氨酸脱羧酶)酶活性高有利于GABA的积累[16]。不同嫩度的茶鲜叶其内含物质含量不同,Glu和GAD酶活性也不同,富集后GABA的含量也会有所不同。

因此,本文考虑到富集成本,采用富集效果好的厌氧间歇技术,以福鼎大白茶为研究对象,综合考虑影响GABA含量的茶叶嫩度、真空度、厌氧时间及富集温度等四个因素,采用正交实验设计确定厌氧间歇技术富集不同等级茶鲜叶GABA的最佳条件,以期为生产高含量GABA茶提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

福鼎大白茶 贵州贵阳,鲜叶采摘标准为一芽一叶至一芽四叶不同等级,采摘时间为2016年7月;2,4-二硝基氟苯(FDBN)、γ-氨基丁酸标准品 美国Sigma公司,99%;四氢呋喃、甲醇、冰乙酸等 均为色谱醇;无水乙醇、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、醋酸钠、福林酚、茚三酮等 均为分析醇。

LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司;DZ600-2S真空包装机 海诺机械;超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;微波炉 格兰仕微波炉;HWS-26电热恒温水浴锅 上海齐欣科学仪器有限公司;UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津等。

1.2 实验方法

1.2.1 不同真空厌氧处理 称取茶鲜叶200 g于铝箔袋中,采用真空包装机进行抽真空使其达到低氧厌氧环境,再通过解封进行室内摊晾使其达到有氧环境,设计不同的实验处理。具体实验处理如下:对照CK:未经真空厌氧处理的鲜叶200 g→80 ℃烘干固样;处理1:鲜叶200 g→真空厌氧3 h→80 ℃烘干固样;处理2:鲜叶200 g→真空厌氧3 h→有氧2 h→80 ℃烘干固样;处理3:鲜叶200 g→真空厌氧3 h→有氧2 h→真空厌氧3 h→80 ℃烘干固样;处理4:鲜叶200 g→真空厌氧6 h→80 ℃烘干固样;处理5:鲜叶200 g→真空厌氧3 h→有氧2 h→真空厌氧3 h→有氧2 h→真空厌氧3 h→80 ℃烘干固样;各处理茶样均采用干研磨机磨碎茶样,置于自封袋内,并做好标记,以待测备用。

1.2.2 正交实验设计 在1.2.1中实验结果的基础上,采用一次真空厌氧间歇技术富集茶叶中GABA,确定影响GABA因素有厌氧时间,同时参考文献[12-16]资料研究结果影响GABA因素的还有茶叶等级、真空度、富集温度,设计了L16(45)正交实验设计方案,因素水平表如下表1所示。

表1 正交实验因素水平编码Table 1 Code of factors and levels for orthogonal

1.2.3 鲜叶富集后的色泽及气味判断方法 实验中判断鲜叶富集后的色泽及气味的方法主要采取感官方法,长期从事茶叶加工的人员5人组成,分别就处理样品进行感官判断。富集处理后茶鲜叶绿、青气或略带闷味,实际生产中可以接受;若富集处理后茶鲜叶出现大量黄变、红叶红梗、闷味重、闷臭味,则不符合实际生产要求。

1.2.4 检测方法

1.2.4.1 GABA含量测定 色谱柱:AgilentTC-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相:A相为5 mmol/L 醋酸钠溶液(pH5.7,含5%四氢呋喃),B相为甲醇;流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;检测波长:360 nm;进样量:20 μL[17]。

1.2.4.2 其他测定方法 茶叶中水分测定参照GB/T 8304-2013;茶叶中茶多酚测定参照GB/T 8313-2008;茶叶中游离氨基酸总量测定参照GB/T 8314-2013;茶叶中咖啡碱的测定方法参照GB/T 8312-2002。

1.3 数据处理

实验处理重复3次,用IBM SPSS Statistic 20.0软件及Excel软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)及Duncan法多重比较。实验结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 FDBN柱前衍生高效液相色谱法测定GABA结果

由图1可知,对GABA的单标进行测定后,结果发现GABA的出峰时间约在22.7 min左右,并经验证在17.5 min左右出现的是溶剂峰。其中测得GABA的标准曲线为y=0.0533x+0.0562(R2=0.9997)线性较好。

图1 GABA单标色谱图Fig.1 GABA single chromatogram

图2 GABA标准曲线Fig.2 The standard of GABA

2.2 不同真空厌氧处理对GABA含量的影响

针对不同真空厌氧处理对GABA富集含量的影响,本实验做了5个处理,实验结果如图3所示,未经厌氧处理的茶叶中GABA的含量很低,仅为(0.21±0.02) mg/g,但经过厌氧处理后,每个处理的GABA含量与对照相比均有明显的增加(p<0.05)。真空处理使茶鲜叶处于厌氧逆境状态下,激活GAD酶,酶活性增加,从而促使GABA积累量增加。

图3 不同真空厌氧处理茶鲜叶中GABA的含量Fig.3 GABA content of the tea leaf in different anaerobic condition注:图中不同小写字母表示经Duncan 差异显著性检验在0.05水平差异显著。

比较处理1、处理4可知,连续真空处理茶鲜叶6 h的GABA含量比连续处理3 h的要高出24%,但两者之间并不存在显著性差异(p>0.05)。茶鲜叶在连续6 h真空处理的过程中,其GABA的合成主要集中在前3 h,后3 h的GABA生成量明显大幅减少,仅为0.28 mg/g,这可能与GAD的活性受底物谷氨酸(Glu)浓度调节有关,随着厌氧时间的延长,Glu不断减少,降低了GAD对其的利用,GABA的合成速度降低[18],说明并不是连续厌氧时间越长,GABA生成量就越多。

处理2在处理1的基础上增加了2 h的有氧处理,GABA含量并无显著变化(p>0.05);处理3在处理2的基础上又真空处理3 h后,使其真空厌氧时间达到6 h,GABA增加到(2.05±0.12) mg/g,与处理4连续真空处理6 h相比,GABA增加了44%,差异显著(p<0.05)。说明在厌氧处理时间后,适当增加一定的有氧时间,可以提高茶鲜叶中的GABA含量。这与Glu在一定范围内的摊放前期是呈上升趋势有关[19-20]。

处理5在处理3的基础上,对茶鲜叶又增加了一次真空厌氧处理3 h、有氧处理2 h的循环,因而鲜叶累计处理时间达到13 h,其中厌氧处理时间为9 h,茶叶中GABA的含量高达(2.43±0.18) mg/g,比处理3高出19%,但变化差异不明显(p>0.05)。研究表明真空厌氧处理时间或间歇厌氧处理时间过长,都会对成茶品质造成一定的影响[21]。处理3与处理4相比,由于在2 h的摊放过程中,热量散失,水汽减少,芽叶红变现象极少,闷味也有所减轻,但是处理5经过两次厌氧3 h/有氧2 h间歇处理的时间过长,红变现象较重,红梗红叶较多,闷味较重,严重影响了茶叶的品质。

处理3的GABA含量为(2.05±0.12) mg/g,并高于GABA茶的标准[6],因此,在兼顾GABA的含量及茶叶品质的同时,处理3即按照一次真空厌氧间歇(真空厌氧3 h→有氧2 h→真空厌氧3 h)富集GABA的效果最为理想。

2.3 正交实验结果分析

在厌氧条件下,茶鲜叶中的L-Glu在GAD的催化作用下脱去羧基,生成GABA。因此,将影响GAD酶促反应生成GABA的四个因素A鲜叶嫩度、B真空度、C富集温度[12-16]、D厌氧时间进行正交优化实验,结果见表2～表4。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

表4 不同真空厌氧间歇富集后茶鲜叶内含物及色泽变化Table 4 GABA content and color change of the tea leaf in different anaerobic condition

由表2中的极差R值的大小和表3的F测验结果分析可知,真空度B是影响茶叶中GABA含量的主要因素,其次是厌氧时间。鲜叶嫩度和富集温度的四个水平均没有明显的差异性。

不同真空度对茶叶中GABA含量的影响在F0.01(3,3)水平下极为显著,四个水平中最优的水平是真空度为B4,即0.09 MPa。说明采用真空作为厌氧处理条件时,真空度越高,茶叶中GABA的含量也越高,这可能是由于茶鲜叶在绝对厌氧条件下更有利于激发GAD酶活性,从而促进GAD酶促反应生成GABA。

厌氧处理时间在F0.05(3,3)水平下显著,四个水平中最优的是D2,即真空厌氧3 h→有氧2 h→真空厌氧3 h,之后,随着厌氧处理时间加长,其GABA的含量却有所减少,说明在提高茶叶中GABA含量时,并不是厌氧处理的时间越长越好。这可能是由于茶叶中的Glu是具有一定量的,在经过一段时间的酶促反应后,已被完全转化的缘故。厌氧时间对茶叶品质影响较大,由表4可知,厌氧处理时间过长,不仅会造成较多的红梗、红叶,而且还极易产生一种“闷味”。

鲜叶嫩度对茶叶中GABA含量的影响不显著(p>0.05),其中四个水平中最优的水平是B2一芽二叶。从表2中鲜叶嫩度各个水平的平均值来看,用茶鲜叶的一芽二、三叶来富集GABA的含量效果较好,这可能是由于一芽二、三叶的氨基酸含量相对较高,给GAD酶促反应提供了较为充足的反应条件,其机理还有待进一步的研究。富集温度对茶叶中GABA含量的影响在本实验中未达到显著水平,说明厌氧温度对GABA含量基本无影响。

但是,鲜叶嫩度、厌氧时间和温度对茶叶品质有一定的影响。由表4可知,不同嫩度的茶鲜叶其氨基酸、茶多酚、咖啡碱的含量也不同,在同一嫩度中,与未经厌氧处理的对照组相比,真空厌氧处理后的茶叶氨基酸总量均略有增加,茶多酚的含量均有不同程度的降低,而咖啡碱的含量变化不明显。不同嫩度的茶叶处理温度在4 ℃、15 ℃的条件下,温度在26 ℃下茶鲜叶富集后的色泽都能保持正常的绿色,而当处理温度到达37 ℃时,间歇厌氧富集处理一芽二叶鲜叶6 h后就发生“红变”,连续厌氧处理一芽一叶5 h叶片就会变黄。这是因为茶鲜叶中含有大量的多酚氧化酶(最适温度35 ℃)、过氧化物酶等酶类,采摘下来的茶鲜叶若不及时进行“高温杀青”灭酶,多酚类物质极易被氧化出现“红变”现象,造成红梗、红叶[22]。所以,表2中厌氧温度的最优水平是C1即温度4 ℃,但温度在室温26 ℃下进行厌氧处理,对GABA的含量影响也不大,综合考虑到茶叶品质和实际应用时,可以选择在26 ℃下进行厌氧处理。

3 结论

本文采用一次真空厌氧间歇富集技术对4个不同嫩度的茶鲜叶进行了优化,结果发现:采用真空作为厌氧处理条件时,真空度对GABA含量的影响极为显著,真空度越高,GABA的含量越高。厌氧处理时间对GABA含量影响显著(p<0.05),在一定范围内,厌氧处理时间越长,其GABA的含量越高,但超过一定的时间后,GABA的含量不再增加反而减小。鲜叶嫩度、厌氧处理温度对GABA含量的影响不大,但温度对茶叶品质影响很大,如厌氧处理温度在37 ℃,一芽一叶茶鲜叶经过5 h厌氧处理叶片就会变黄。由于夏、秋季温度较高,所以在对茶鲜叶进行厌氧处理时,应适当降温。

总之,综合考虑到GABA及茶叶主要内含物质氨基酸、茶多酚的含量,结果表明采用一芽二叶的鲜叶经真空厌氧间歇处理8 h富集GABA的效果最为理想,即一芽二叶在26 ℃,0.09 MPa条件下,按照先真空厌氧3 h,再有氧2 h,最后真空厌氧3 h的处理方式富集GABA效果最好,含量可达192.79 mg/100 g,氨基酸、茶多酚分别可达4.21%、15.80%。

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