南丰蜜桔汁乳酸菌发酵过程中品质的变化

杨 冲,彭 珍,熊 涛

(南昌大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

我国是柑桔原产地之一,年产量居世界第三位,仅次于巴西、美国[1-2],而江西省作为赣南-湘南-湖南-桂北柑桔带的优势区,是全国柑桔的重要产地[3],具有丰富的宽皮柑桔资源[4],以赣南特产南丰蜜桔为代表,历史上就以果色金黄、皮薄肉嫩、食不存渣、风味浓甜、芳香扑鼻而闻名中外。有研究表明,蜜桔中富含有机酸、糖类、VC、VE、β-胡萝卜素、氨基酸和矿物质等营养元素,黄酮类物质和柠檬苦素类物质则构成其特有的苦味成分[5-6]。蜜桔本身具有润肺、止咳、化痰、健脾、顺气、止渴的药效[7]。因此,对蜜桔的研究和开发具有重要的价值。近年来,不仅全汁发酵的系列柑桔果酒、柑桔白兰地和柑桔果醋(调味醋和饮料醋)[8-9]不断被研发,果胶、香精油、橙皮色素、柠檬苦素等系列高附加值产品也在食品、化工、保健品和化妆品等领域广泛应用[[10-12]。但是,关于系统研究乳酸菌发酵蜜桔饮料的相关研究也较少,李辉[13]用酵母菌和乳酸菌复合发酵冬枣柑桔汁,得到了冬枣柑桔复合汁的最佳发酵工艺;李妍等[14]应用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)进行发酵制作乳酸菌发酵饮料,优化发酵工艺;郭丽等[15]对柑桔乳酸菌饮料的工艺进行了研究。相关文献多集中在工艺研究,选用的菌种多集中于保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、酵母菌等,而针对乳酸菌单菌发酵柑桔饮料发酵前后主要成分的变化的研究较少。

本文首次用乳酸菌单菌发酵赣南特产南丰蜜桔汁,探究发酵过程中菌落数、pH、总酸度、有机酸和糖类随发酵时间的变化规律,对发酵前后维生素C、总黄酮、多酚和氨基酸含量进行分析,期望为南丰蜜桔的深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南丰蜜桔 产地江西省南丰县,果形扁圆,果皮薄,均重25 g左右;南丰蜜桔专用乳酸菌剂NCU1125 实验室筛选菌株真空冷冻干燥法制得;果糖、蔗糖、葡萄糖、草酸、乳酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸(标准品) 索莱宝公司;其他试剂 均为国产分析纯。

MideaPHS-25pH型精密pH计 上海精密科学仪器有限公司;HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;WMZK-02型厌氧培养箱 上海华辰医用仪器有限公司;TG16-W微量高速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;HP1260 高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌发酵南丰蜜桔的工艺流程 南丰蜜桔→挑选→压榨→纱布过滤→加7%果葡糖浆调配→水浴灭菌(95 ℃,25 min)→冷却至室温→加入3(m/m)的乳酸菌剂(活菌数1011CFU/mL)→37 ℃恒温发酵(60 h)→发酵后南丰蜜桔汁原浆→蔗糖调配→蜜桔饮料[16]。

1.2.2 pH的测定 取5 mL发酵后的南丰蜜桔汁原浆于小烧杯中,pH计直接测定。

1.2.3 总酸度的测定 按照GB/T 12456-2008碱滴定法测定发酵过程中酸度。

1.2.4 菌落数的测定 平板稀释活菌计数法[17]。取1 mL发酵液加入到9 mL灭菌冷却的生理盐水中,再依次做10倍系列浓度稀释,选取三个适当稀释梯度的发酵液,分別吸取这三个稀释液100 μL于无菌的MRS固体培养基上涂布至稀释液干燥,将培养皿倒置于37 ℃培养箱中,培养24 h后,选取菌落数在30～300个之间的平板进行计数。

1.2.5 有机酸的测定 参照Xiong T等[18]的方法。

1.2.5.1 流动相的配制 0.5 mol/L的硫酸,超声波脱气后备用。

1.2.5.2 色谱条件 AMINEXHPX-87H离子交换柱(300×7.8 mm);流动相为6 mmol/L硫酸溶液,流速为0.5 mL/min,柱温45 ℃,紫外检测器检测波长205 nm;选用示差折光检测器检测糖醇(蔗糖、葡萄糖、果糖)含量,紫外检测器检测草酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、乙酸的含量。

1.2.6 多酚含量的测定 福林酚法[19-20];总黄酮含量的测定:GB/T 12143附录G总黄酮的测定;维生素C含量测定:紫外分光光度法[21]。以上每个样品均重复3次。

1.2.7 游离氨基酸的测定 根据GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》,利用氨基酸分析仪测定南丰蜜桔汁发酵前后氨基酸的种类及含量。

1.2.8 数据处理 实验数据利用SPSS 20.0软件,采用单因素方差分析进行显著性差异比较(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 南丰蜜桔汁乳酸菌发酵过程中总酸度、pH和菌落数的变化

总酸度和pH是发酵过程中极为重要的参数,直接影响着微生物的生长及代谢产物的生成[22],而且在一定程度上间接的反映发酵液微生物的生长代谢情况。因此,在乳酸菌发酵南丰蜜桔汁中,考查总酸度、pH和菌落数随发酵时间的变化规律,对于了解发酵过程中微生物的生长代谢、判断桔汁发酵程度具有指导意义。

由图1(a)可知,在0～2 h左右,是乳酸菌的延滞期,活菌数略有减少,但是3 h以后乳酸菌快速增长进入对数期,在发酵10 h左右进入稳定期,活菌数为3.3×109CFU/mL。在发酵48 h左右,乳酸菌进入衰亡期,60 h以后活菌数仍然保持在2×109CFU/mL,故乳酸菌能够较好的适应桔汁发酵环境,发酵结束后存活率仍在67%以上。

由图1(b)可知,总酸度含量整体呈上升趋势。在0～6 h的发酵期间,总酸度变化不明显,6 h以后,总酸度呈现先快速上升后缓慢的增加直至48 h后稳定不变的趋势,发酵结束后总酸度为15.64 g/kg,较发酵前总酸度提高6倍。可能总酸度的变化与乳酸菌生长特性有关:发酵前期乳酸菌处于迟滞期,此时乳酸菌并不产酸,进入对数期后,乳酸菌利用糖类生长繁殖并产生乳酸等代谢产物;有机酸的产生使桔汁酸度升高[23],随着发酵的进行,桔汁中积累大量有机酸,导致环境中pH下降,高浓度的酸性环境和H+会抑制乳酸菌生长与代谢,进而使菌的产酸能力受到影响,发酵后期酸度变化不明显。

图1 发酵过程中菌落数、总酸度和pH随发酵时间的变化Fig.1 Variation of colony forming unit and total acidity and pH value during the fermentation process

pH在发酵期间呈现下降趋势,在6～12 h迅速下降,此阶段pH的快速下降主要是因为乳酸菌的快速增殖消耗糖代谢产酸。另一方面,由于桔汁开始时的介质缓冲能力较低,所以发酵初期产生的少量乳酸也能导致其pH下降显著。在36 h时,pH下降到3.2,36 h后稳定不变。综上所述,可以看出乳酸菌适应强酸环境发酵桔汁饮料,本实验与Darko Dimitrovski等关于植物乳杆菌PCS26发酵菊芋功能饮料的研究相符[24]。

对比pH的变化,可以看出发酵桔汁中总酸度呈现增加的趋势,发酵36～48 h期间,pH几乎稳定不变,而总酸度仍在缓慢增加。这是由于pH的大小不仅取决于有机酸的种类与数量,而且受桔汁中缓冲物质总量及其缓冲能力的影响[22],因此,pH与其总酸度之间并没有严格的比例关系。

2.2 南丰蜜桔汁乳酸菌发酵过程中糖类物质含量的变化

图2为上述3种底物在桔汁发酵过程中的变化趋势。葡萄糖、果糖和蔗糖是蜜桔汁发酵体系中的主要碳源,初始含量分别为20.97、22.36、42.88 mg/g,主要来源于添加的果葡糖浆和桔汁中本身含有的少量糖类。随着发酵进行,果糖、葡萄糖、蔗糖含量都呈现下降趋势,发酵6 h之后,乳酸菌直接利用果糖和葡萄糖或者本身具有蔗糖水解酶分解蔗糖产生的果糖和葡萄糖进行发酵[25],使得发酵桔汁中果糖、葡萄糖、蔗糖含量快速下降。发酵40 h之后,三者含量的变化缓慢,是因为在发酵后期,发酵桔汁中的环境因素(如高浓度酸,低pH)在一定程度上对乳酸菌有抑制作用,乳酸菌的代谢活动减慢,三糖的利用率逐渐下降[26]。发酵结束后,总糖浓度减少了11.03 mg/g,减少的糖类物质用于菌的生长以及在发酵代谢中转化成其他的有机酸等营养物质。

图2 发酵过程中糖类浓度的变化Fig.2 Changes in glucide concentrations during the fermentation

2.3 南丰蜜桔汁乳酸菌发酵过程中有机酸含量的变化

对不同发酵时间桔汁发酵液取样测定有机酸含量变化,得到发酵液中各有机酸含量变化见图3。

图3 蜜桔发酵过程中有机酸含量的变化Fig.3 Changes of organic acids during the fermentation process of Nan Feng orange

酸是发酵果蔬汁中重要的一种味感,是衡量果汁发酵质量好坏的重要指标之一,有机酸除来自蜜桔原料以外,还在乳酸菌发酵蜜桔的代谢过程中产生。从图3可以看出在蜜桔发酵前,柠檬酸、苹果酸、乙酸含量最高,分别为8.6、4.2、3.9 mg/g,是蜜桔的主要有机酸,此外还检测到草酸和乳酸,但是含量较少。乳酸在整个发酵期间呈现一直增加趋势,由最初浓度0.44 mg/g到发酵结束后浓度13.05 mg/g,含量增加了28倍(p<0.05),这是因为在发酵过程中,乳酸菌利用葡萄糖,经同型发酵中的糖酵解过程,产生了大量的乳酸[27]。

乙酸可能作为乳酸菌的代谢底物被消耗,在发酵中期消失(p<0.05)。发酵后,苹果酸含量下降到3.69 mg/g,减少了近30.3%(p<0.05),这是因为苹果酸可以作为乳酸菌的代谢底物,在苹果酸脱酸酶的催化下,转化成了部分乳酸[29]。柠檬酸是蜜桔中的主要有机酸,柠檬酸含量下降到6.5 mg/g,减少了近22.4%(p<0.05),可能是在发酵过程中,部分柠檬酸作为乳酸菌菌体的营养成分和转化成其他代谢产物[28],而草酸含量在整个发酵过程中并没有显著性变化(p>0.05)。

在发酵结束时有机酸总含量提高了5.5 mg/g,较发酵前显著提高。乙酸、乳酸是乳酸菌发酵果汁产生的短链脂肪酸[29-30],短链脂肪酸含量由发酵前的5.23 mg/g增加到发酵后的13.05 mg/g,其中乳酸酸味柔和醇厚,是发酵后桔汁中主要的短链脂肪酸。有机酸对蜜桔发酵过程中的乳酸菌有抑制作用对原浆的风味有重要影响,正是不同有机酸在发酵果蔬汁的风味形成中既发挥各自独特的作用,又会相互协调[31],形成了发酵蜜桔汁独特的发酵风味。

2.4 南丰蜜桔汁乳酸菌发酵过程中主要抗氧化物质含量的变化

人体的衰老效应和多种疾病与体内自由基有关。实验证明食物中尤其是水果和蔬菜中含有的多酚、黄酮、维生素等物质具有抗氧化性,可清除体内有害自由基,延缓衰老进程,预防各种慢性疾病的发生[32-33]。

发酵前后维生素C、总黄酮和多酚的含量测定结果见表1。由表1可知,经乳酸菌代谢产生的低pH环境具有保护维生素C不被氧化、分解的作用[34],蜜桔经乳酸菌发酵后,维生素C的含量减少,但仍保持在80%以上,可能是部分维生素C作为代谢底物被乳酸菌在发酵中利用,产生有机酸和转化其他维生素,果汁中具有抑菌作用的多酚类物质[35]和蛋白质反应生成大分子聚合物[36],而总黄酮和多酚物质含量却在发酵后显著性增加(p<0.05)。一方面乳酸菌在发酵过程中能产生某些酯酶水解一些结合酚,释放果蔬中的游离酚。另一方面,发酵过程中产生的有机酸,也会防止酚类物质的降解[37],此外,乳酸菌在发酵过程中产生一些酚酸脱羧酶,能使酚类物质之间实现相互转化,可能把复杂的大分子酚类物质转化成小分子酚类物质[38-39]。

表1 蜜桔饮料发酵前后成分变化Table 1 Changes of components of Nan Feng orange before and after fermentation

2.5 南丰蜜桔汁乳酸菌发酵前后游离氨基酸含量的变化

利用氨基酸分析仪测定南丰蜜桔汁发酵前后氨基酸的种类及含量,结果见表2,由表中可知,发酵前南丰蜜桔浆中共检测出17种氨基酸,总量为2.28 mg/g,其中必需氨基酸有7种,分别是缬氨酸(0.019 mg/g)、赖氨酸(0.046 mg/g)、异亮氨酸(0.009 mg/g)、亮氨酸(0.013 mg/g)、蛋氨酸(0.004 mg/g)苏氨酸(0.038 mg/g)和苯丙氨酸(0.053 mg/g),占游离氨基酸的7.9%。蛋氨酸和半胱氨酸为南丰蜜桔中的限制性氨基酸。发酵后游离氨基酸总量为1.961 mg/g,较发酵前显著减少(p<0.05),其中异亮氨酸、酪氨酸在发酵后未被检出,天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸含量显著性减少(p<0.05),在发酵后期含量下降可能是因为微生物的大量繁殖利用程度强于相关蛋白质的水解强度以及这些氨基酸在发酵过程下发生了氧化和转化[40],也可能被乳酸菌代谢利用合成其他挥发性芳香物质;半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸在发酵后含量均有所增加,可能是发酵后期乳酸菌死亡,菌体蛋白降解导致[41],丙氨酸为南丰蜜桔发酵后的限制性氨基酸。

表2 南丰蜜桔汁发酵前后氨基酸变化Table 2 Changes of amino acid of Nan Feng orange before and after fermentation

参照YLVA A等[41-43]的分类方法,根据呈味不同,氨基酸可以分为甜味氨基酸(Ala、His、Pro、Ser、Thr、Gly)、鲜味氨基酸(Glu、Lys、Asp)、苦味氨基酸(Arg、Ile、Leu、Val、Trp、Met)、酸味氨基酸(Asp、Gly)和芳香味氨基酸(Tyr、Cys、Phe)。由图4可知,南丰蜜桔发酵后呈味氨基酸组成发生变化,鲜味氨基酸由0.251 mg/g减少到0.09 mg/g,苦味氨基酸由1.095 mg/g减少到0.891 mg/g,减少了18.6%,酸味氨基酸含量由0.167 mg/g增加到0.27 mg/g,甜味氨基酸含量由0.862 mg/g减少到0.682 mg/g,芳香味氨基酸含量由0.074 mg/g减少到0.012 mg/g。南丰蜜桔的口感是由氨基酸与糖类、酸类、酯类等其他呈味物质共同作用产生的,发酵后酸味氨基酸含量增多,加之苦味氨基酸含量显著性减少(p<0.05),一定程度改善了南丰蜜桔的口感。

图4 南丰蜜桔汁发酵前后呈味氨基酸的变化Fig.4 Changes of flavor amino acids of Nan Feng orange before and after fermentation 注：不同字母表示发酵前发酵后 氨基酸含量差异显著(p<0.05)。

3 结论

乳酸菌能够较好的适应南丰蜜桔汁发酵环境,发酵3 h左右,乳酸菌进入对数期,10 h后进入稳定期,60 h以后活菌量仍然在2×109CFU/mL,发酵结束后pH下降至3.2左右,总酸度显著性提高了近6倍(p<0.05)。乳酸菌发酵对草酸含量没有显著影响(p>0.05),柠檬酸、苹果酸、乙酸含量呈下降趋势,特别是乙酸在发酵中期消失,乳酸显著性增加(p<0.05),质量浓度由0.44 mg/g增加至13.05 mg/g。短链脂肪酸由发酵前的5.23 mg/g增加到13.05 mg/g,大大提高了蜜桔的保健功能。南丰蜜桔汁发酵前后,维生素C含量显著性减少(p<0.05),总黄酮和多酚类化合物含量显著性增加了12.9%和8%(p<0.05)。发酵后氨基酸总量减少了13.9%,呈味氨基酸组成发生变化。乳酸菌可以作为发酵型南丰蜜桔汁的发酵剂,南丰蜜桔汁乳酸菌发酵可以提高其营养保健价值,改善风味。

[1]余学军. 我国柑桔国际竞争力研究[D]. 重庆：西南农业大学,2004.

[2]陈晓明. 中国柑橘出口国际竞争力研究[J]. 林业经济,2015,37(1):82-86.

[3]王毅. 赣南地区柑桔产业化研究[D]. 武汉：华中农业大学,2005.

[4]朱凤妮,卢剑青,陈金印,等. 江西省六种宽皮柑桔类黄酮及挥发油成分的研究[J]. 果树学报,2017,34(9):1-17.

[5]黄岛平,林葵,黄文琦,等. 广西桔子果汁中的6种特征化学成分分析[J]. 经济林研究,2013,31(4):187 -189.

[6]钱爱萍,林虬,余亚白,等. 闽产柑桔果肉中氨基酸组成及营养评价[J]. 中国农学通报,2008,24(6):86-90.

[7]陈卫民. 柑桔的营养与药用及副产品利用[J]. 浙江柑桔,2013, 30(3):26-29.

[8]单杨. 中国柑桔工业的现状、发展趋势与对策[J]. 中国食品学报,2008,8(1):1-8.

[9]李高阳. 柑桔果醋及柑桔果醋饮料的研究[D]. 长沙：湖南农业大学,2002.

[10]Lee Y H, Charles A H,Kungh F,et al. Industrial Crops and Products, 2010, 31(1):59-64.

[11]Wu F F, Jin M M, Xu X M,et al. Electro fluidic pretreatment for enhancing essential oil extraction from citrus fruit peel waste[J]. Journal of Cleaner Production, 2017, 159：85-94.

[12]温志英,刘焕云. 柑桔加工废料综合利用现状及发展前景[J]. 食品研究与开发,2008,29(11)：162-166.

[13]李辉,邹志远,李其久. 多菌种发酵冬枣贡柑复合汁饮料的研制[J]. 饮料工业,2008,11(12):41-42.

[14]李妍,叶翠香. 贡柑乳酸菌发酵饮料工艺研究[J]. 食品工业科技,2008,29(1):209-210.

[15]郭丽,朱林,孔晓玲. 柑桔乳酸菌饮料制作工艺的研究[J]. 农业机械学报,2006,37(8):52-55.

[16]李海萍. 益生菌发酵蜜柚饮料工艺技术研究[D].南昌：南昌大学,2015.

[17]熊涛, 黄锦卿, 宋书华, 等. 植物乳杆菌发酵培养基的优化及其高密度培养技术[J]. 食品科学,2011,32(11):114-117.

[18]Xiong T, Li J, Liang F, et al. Effects of salt concentration on Chinese sauerkraut fermentation [J]. LWT - Food Science and Technology, 2016, 69:169-174.

[19]冀晓龙. 杀菌方式对鲜枣汁品质及抗氧化活性的影响研究[D].杨凌：西北农林科技大学,2014.

[20]郭晓敏. 赣南四个不同品种脐橙成熟果实的体外抗氧化性研究[D]. 南昌：江西农业大学,2011.

[21]李占清,魏海英. 分光光度法测定新鲜蔬菜中维生素C的含量[J].中国无机分析化学,2014,4(3):79 -81.

[22]曹云刚,马丽,杜小威,等. 汾酒酒醅发酵过程中有机酸的变化规律[J]. 食品科学,2011,32(7):229-232.

[23]Michin A O, ensuke S, Koji N, et al. Inhibition of in vitro growth of Shiga toxin-producingEscherichiacoliO157:H7 by probioticLactobacillusstrainsdue to production of lactic acid[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 68(1):135-140.

[24]Darko D, Elena V, Maja D, et al. Symbiotic functional drink from Jerusalem artichoke juice fermented by probioticLactobacillusplanetariumPCS26[J]. J Food Sci Technology, 2016,53(1):766-774.

[25]Kleerebezem M, Boekhorst J, Van K R, et al. Complete genome sequence ofLactobacillusplanetariumWCFS1 [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(4):1990-1995.

[26]熊涛,彭飞,李啸,等. 传统发酵泡菜优势微生物及其代谢特性[J].食品科学,2015,36(3):158-161.

[27]马晓娟. 乳酸菌发酵胡萝卜原浆技术及其产品性能研究[D].南昌：南昌大学,2013.

[28]余元善. 一种同时生产乳酸菌发酵青梅饮料和低酸性青梅蜜饯的方法：中国, CN 104431240 A[P]. 2015-03-25.

[29]张宁,曾艳华,吴希阳,等. 中性大蒜果聚糖体外发酵产短链脂肪酸[J]. 食品与发酵工业,2013,39(1):51-54.

[30]刘虎,任傲,方热军. 短链脂肪酸的作用及其调控机理[J]. 中国猪业,2015,10(11):55-57.

[31]沈颖,刘晓艳,白卫东,等. 果酒中有机酸及其对果酒作用的研究[J]. 中国酿造, 2012,2(31):30.

[32]石玉平,卢挺,王永宁. 油菜蜂花粉中黄酮类物质清除羟基自由基的研究[J]. 食品科学,2004,(11):300-302.

[33]郭长江,高蔚娜,谢宗恺,等. 中国蔬菜、水果抗氧化作用与有效成分的研究进展[J]. 生命科学,2015,27(8):1000-1004.

[34]Raffaella D C,Rosalinda F S,Annalisa P, et at. Effect of autochthonous lactic acid bacteria starters on health-promoting and sensory properties of tomato juices [J].International Journal of Food Microbiology,2009,128(3):473-483.

[35]Di C R,Coda R,De A M,Gobbetti M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation[J]. Food Microbiol,2013,33(1):1-10.

[36]孙海峰, 吕海涛, 周莎莎, 等. HPLC法测定苹果浓缩汁中的多酸类物质内[J].食品科学，2008,29(4):314-316

[37]Szwajgier D, Wa K A, Targo S Z, et al. The use of a novel frolic acid esterase fromLactobacillusacidophilusK1 for the release of phenolic acids from brewer’s spent grain [J]. J I Brewing, 2010, 116(3):293-303.

[38]Rodr Guez H L, Landete J M, Curiel J A, et al. Characterization of the p-comedic acid decarboxylase fromLactobacillusplanetariumCECT 748[J]. J Agr Food Chem, 2008, 56(12): 3068-3072.

[39]Chu S C, Chen C H. Effects of origins and fermentation time on the antioxidant activities of kombuclia [J]. Food Chemistry，2006, 98(3):502-507.

[40]吴清华,张浩,莫海珍,等. 绿茶发酵过程中茶多酚和氨基酸的变化[J]. 江西农业学报,2013,25(5):110-113.

[41]杨波, 张婷, 罗瑞明,等. 沙葱发酵过程中氨基酸组成与含量变化对其营养与风味的影响[J]. 食品科技, 2014,39(11):74-79.

[42]Ylva Ardö. Flavors formation by amino acid catabolism [J]. Biotechnology Advances, 2006,24(2):238-242.

[43]颜孙安, 林香信, 钱爱萍, 等. 闽产柑桔果实氨基酸含量及组成分析[J]. 中国食物与营养,2012,18(6):66-70.