前列地尔联合针刺对噪音性耳聋大鼠耳蜗毛细胞血管内皮生长因子、Bcl-2及Bax表达的影响

贾占伟，何强，张玉波，韩海霞

(河北医科大学第二医院耳鼻喉科，河北 石家庄 050000)

当今社会，噪声污染已成为了人类听力健康的主要杀手之一。噪音会伤害耳朵感声器官(耳蜗)的感觉发细细胞，进而对人类听觉系统造成不同程度的破坏。其原理推断为噪声可以造成耳蜗微循环障碍[1]。机体的感觉发细细胞一旦受到伤害，则永远不会复原，长时间的伤害会形成噪音性耳聋。目前治疗耳聋的方法主要有中医治疗、西医治疗及仪器治疗。近年来，中医针灸被越来越多的用于耳聋的治疗。本研究从耳蜗基底膜毛细胞毛细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、耳蜗相关凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA的表达为切入点，通过动物实验, 采用RT-PCR的方法，研究针刺联合前列地尔对噪音性大鼠耳蜗组织VEGF、Bcl-2、BaxmRNA表达的影响及其作用机制, 为临床应用针刺联合前列地尔治疗耳聋疾病患者提供理论依据和实验资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和分组 Wistar大鼠(SPF级)32只，体质量(200±15)g，无中耳炎， 由河北省药品检验所提供，批号为SCXK(冀)2004-1-005。按照随机数字法分为4组：空白对照组、模型组、前列地尔治疗组和针刺联合前列地尔治疗组，每组8只。

1.1.2 仪器 隔音室，北京中医药大学附属医院提供；81150A 脉冲函数任意噪声发生器(是德科技有限公司)；A-K200功率放大器(苏州景通仪器有限公司)；倍频程噪声光盘(北京中医药大学听力研究室)；TES-1350A型声级计(苏州景通仪器有限公司)；听觉脑干电位仪(Waters，美国)；FDH-39型耳机(苏州景通仪器有限公司)；光学显微镜(苏州景通仪器有限公司)。

1.1.3 试剂 苏木素伊红(HE)染色试剂盒(北京弘博康医药科技有限公司)，氢化可的松注射液，(天津金耀氨基酸有限公司，批号0503171)；Real-Time PCR试剂盒(大连TaKaRa 公司)；Anti-Bax:(Abcam 公司，货号:ab115193)；Anti-Bcl-2(Aabcam 公司，货号:ab117115)；EDTA(北方百胜国际生物技术有限公司)；免疫组化SABC试剂盒(南京建成生物工程有限公司)；DAB(上海图赫实业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 除对照组外，将其余3组大鼠置于小笼内(30 cm×30 cm×100 cm)，每笼2只，放入暴露舱(1.0 m×0.5 m×1.0 m)，利用81150A 脉冲函数任意噪声发生器发声。噪音频率3 000 Hz，声强116 dB 声压级(sound pressure level，SPL)。大鼠暴露范围内声扬不均匀度为±2 dB。每天暴露8 h，共暴露7 d。造模前及造模结束后，检测各组大鼠听觉脑干诱发电位(auditory brainstem response，ABR)听力阈值。检测方法相关参考文献[2]。

1.2.2 治疗方法 造模完成后, 空白组与模型组每天灌胃12 mL/kg生理盐水。从暴露前1 d至暴露后20 d，前列地尔组给予实验大鼠灌胃处理(前列地尔，6 mg·kg-1·d-1，每天1次，共28 d；针刺联合组在前列地尔治疗的基础上，选三焦经腧穴“翳风”(双)、“外关”(双)进行针刺处理，每天1次，每次留针25 min，共28 d。

1.2.3 观察指标 (1)耳蜗毛细胞VEGF染色：取各组大鼠耳蜗，10%甲醛固定，EDTA 脱钙，用不同浓度的酒精逐级脱水处理24 h，石蜡包埋，切片。采用ABC 法进行染色，观察记录；(2)耳蜗组织Bcl-2 mRNA的表达：取各组大鼠耳蜗，-70 ℃冰箱保存。将其充分研磨，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法，进行耳蜗组织Bcl-2 mRNA表达的检测；(3)耳蜗组织Bax mRNA的表达：取各组大鼠耳蜗，-70 ℃冰箱保存。将其充分研磨，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法，进行耳蜗组织Bax mRNA表达的检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠ABR听力阈值

由表1可见，造模结束后，各组大鼠ABR听力阈值均显著高于对照组，差异有统计学意义，P<0.05。且造模3组大鼠ABR听力阈值比较，差异无统计学意义，P>0.05。

表1 各组大鼠ABR听力阈值

*P<0.05，与对照组相比。

2.2 各组大鼠耳蜗基底膜毛细胞VEGF表达

模型组大鼠耳蜗基底膜毛细胞中VEGF 表达较空白对照组低，差异有显著性意义(P<0.05)；与模型组相比，针刺联合组大鼠耳蜗基底膜毛细胞VEGF表达较强，差异有显著性意义(P<0.01)，表明针灸联合前列地尔治疗可以升高VEGF在耳聋模型大鼠耳蜗基地毛细胞中的表达水平，见图1及表2。

表2 各组大鼠耳蜗基底膜毛细胞VEGF表达灰度值

组别耳数VEGF对照组1673.1±11.0模型组1646.5±9.7*前列地尔组16110.4±15.3针刺联合前列地尔组16123.9±18.6#

*P<0.05，与对照组比较；#P<0.01，与模型组比较。

2.3 各组大鼠耳蜗组织Bcl-2及Bax mRNA表达

与空白组比较，模型组耳蜗组织中Bcl-2 mRNA表达减弱，Bax mRNA表达增强，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针刺联合组Bcl-2 mRNA表达增强，Bax mRNA表达减弱，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表3。表明针灸联合前列地尔治疗耳聋大鼠可使其Bcl-2 mRNA表达增强，同时抑制Bax mRNA过度表达，保护耳蜗结构。

表3 各组大鼠耳蜗Bcl-2及Bax mRNA表达

*P<0.05，与对照组比较；#P<0.01，与模型组比较。

3 讨论

耳聋又名 “重听”[3]，是一种听力障碍疾病。噪音性耳聋的主要形成原因是长时间的遭受高音贝刺激。发生噪音性耳聋后，最早出现的症状是耳鸣，常为高音调耳鸣，同时患者也会出现渐进性听力下降，并且伴有头晕、头痛等症状。噪声刺激会导致耳蜗血流循环障碍，引起细胞缺氧，最终导致内耳毛细胞或其他听神经受损。噪音性耳聋一旦形成，很难被治愈，患者的生活质量将受到严重的影响。近年来，噪音性耳聋的发病率呈现逐年上升的趋势。

研究表明，生物机体耳蜗内的血管收缩、血流速变慢，血流量减少等情况都与长时间高强度的噪声刺激有关系，进而会出现内皮细胞通透性增加，血管内血液黏度增大，形成血栓，堵塞毛细血管，形成噪音性耳聋的情况[4-10]。机体内存在一种可以促进血管内皮细胞生长的物质，即VEGF，具有高度的特异性。它在机体内部对血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成都有一定的促进作用。Bcl-2是机体内部的一种癌基因。CytC自线粒体释放与它有着密切的关系，通过对线粒体释放的控制来实现对凋亡过程的抑制作用[10-12]。与此同时，研究发现机体凋亡活动过程被抑制的关键因素之一是体内Bax蛋白与Bcl-2蛋白之间的比例，由此可见 Bax蛋白在控制细胞凋亡的过程中，也发挥着举足轻重的作用，值得对其作用机制进行深入研究[13]。

近年来随着中医治疗的发展，针灸也越来越多的被用于耳鸣耳聋的治疗上。针灸包括针刺及艾灸，两者联合应用，可以起到打通耳部周围穴位，增加血液流动性，改善耳部周围血液循环的作用，对于耳聋耳鸣的治疗有一定的临床疗效。翳风是针刺及艾灸常用的穴位之一，为肾气朝耳之所入，三焦元气之所出的穴位，与人体的大脑相连，有镇静聪耳开窍的功效，是治疗耳聋常用穴。除此之外，外关也是针刺艾灸常用穴位，可以沟通手厥阴心包经，具有通阳维脉的作用[3]。因此取此两穴作为本次实验治疗噪音性耳聋大鼠的针刺穴位。

实验发现，模型组大鼠耳蜗基底膜毛细胞VEGF 表达较空白对照组大鼠低，耳蜗Bcl-2 mRNA表达减弱，Bax mRNA表达增强，差异有统计学意义(P<0.05)，表明噪声暴露可引起耳蜗组织缺氧，同时耳蜗组织的缺氧也可引起VEGF 的表达降低，进而影响耳蜗Bcl-2、Bax mRNA的表达。与模型组相比，针刺联合组大鼠VEGF 表达升高，Bcl-2 mRNA表达增强，Bax mRNA表达减弱，差异有统计学意义(P<0.05)，表明针刺联合前列地尔治疗能够有效的调节大鼠耳蜗VEGF、耳蜗Bcl-2、Bax mRNA的表达。

综上所述，针刺联合前列地尔治疗能够有效的促进耳蜗血供的恢复，此法对噪音性耳聋的治疗效果比单独使用前列地尔好。但对于其他类型的耳聋，其疗效有待进一步实验研究。

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