rs2231142位点多态性与川东北地区人群原发性痛风的关系

蒋红，贾艾敏，王丽恒，邱亚，青玉凤，蔡燕，杨明辉,

(川北医学院附属医院，1.风湿免疫研究所；2.医学研究中心；3.检验科；4.风湿免疫科，四川 南充 637000)

痛风性关节炎是由于嘌呤代谢紊乱，导致尿酸生成过多而诱发关节炎的炎症性疾病，由先天性嘌呤代谢障碍和尿酸排泄减少所致的痛风称为原发性痛风。尽管痛风的发病机制仍然不清楚，但越来越多的证据显示原发性痛风60%与遗传因素有关，且约90%原发性痛风和高尿酸血症是由于尿酸排泄减少所致[1-2]。三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette,sub-family G,member 2，ABCG2)是一个高容量的尿酸分泌型转运蛋白，主要在近曲小管的管腔膜侧表达，必须形成同型二聚体才能发挥转运尿酸的活性，研究表明ABCG2 蛋白主要参与肾脏尿酸的分泌[3]。其单核苷酸多态性(SNP)rs2231142位点变异引起ABCG2蛋白的141位的谷氨酸(Q)变成赖氨酸(K)，尿酸转运活性较野生型明显下降，进而引起血尿酸明显升高，导致痛风发生[3]。

研究表明，ABCG2蛋白rs2231142(A/C)基因多态性与痛风的发生密切相关，且rs2231142多态性的分布具有明显的地域性和人群差异性特征[3-6]。本实验对川东北地区男性痛风患者ABCG2基因rs2231142多态性与痛风的相关性进行研究，为该地区原发性痛风的发病机制研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本实验选取2013年1月至2015年12月在川北医学院附属医院风湿血液科诊断为原发性痛风的175例男性患者作为病例组，年龄18～85岁，平均年龄(47.8 ±13.4)岁。纳入标准：原发性痛风诊断标准依据1977年美国风湿病学会诊断标准[7]；排除标准：排除近期服用可能导致尿酸升高药物的患者，排除任何可能导致尿酸升高的疾病，排除因嘌呤代谢酶导致的尿酸代谢缺陷[8-9]。同时，选取无高尿酸血症及痛风既往史和家族史，无其它自身免疫性疾病，与病例组年龄、性别、职业特点无明显差异的277例健康体检者作为对照组，年龄 23～78岁，平均年龄(46.5±12.8)岁。

1.2 外周血DNA提取

用EDTA抗凝管抽取175例痛风患者和277例健康对照人群的静脉血3 mL，室温反应30 min，分离血浆，将剩余血液成分按每管500 uL进行分装，做好标记，于-80 ℃保存备用。使用前将冻存的血液于37 ℃水浴溶解，用天根的血液DNA提取试剂盒(离心柱法)提取外周血DNA，按试剂盒说明书进行外周血DNA提取；用Pultton P200+超微量分光光度计检测DNA浓度和质量，OD260/OD280=1.8～2.0表示DNA提取效果较好，可用于Taqman-MGB探针法SNP分型。

1.3 Taqman-MGB探针法检测rs2231142位点多态性

从ABI公司购买rs2231142位点对应的Taqman-MGB探针，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)Taqman-MGB探针法检测样本SNP位点基因型及等位基因频率：只检测到VIC信号，表明所测样本基因型为CC型；只检测到FAM信号，表明所测样本基因型为AA型；同时检测到VIC信号和FAM信号，表明基因型为CA型。反应体系5 μL：TaqMan Universal PCR Master Mix (2×)2.50 μL，40×SNP Genotyping Assay 0.25 μL，模板DNA 1 μL；反应条件为：95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；扩增在ABI QuantStudio 12K荧光定量PCR仪上进行。

1.4 统计学分析

按照Taqman-MGB探针说明书统计实验结果，hardy-weinberg平衡检测对照组的群体代表性，P>0.5，表明所选样本具有群体代表性；P<0.5，表明所选样本不具有群体代表性。用χ2检验分析病例组与对照组的基因型和等位基因型差异，分析结果用OR值和95%的置信区间(95% CI)表示；P<0.05，表示差异具有显著性；P<0.01，表明差异极显著。SHEsis在线分析软件用于结果统计。

2 结果

2.1 DNA提取质量检测

OD260/OD280=1.8～2.0表示DNA提取质量良好，且用于Taqman-MGB探针法SNP分型效果好。对于OD260/OD280<1.8，说明样品中酶和蛋白含量过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；OD260/OD280>2.0，说明样本中RNA含量过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA。或者用分装的血液标本进行二次抽提，保证DNA提取质量满足分型要求。

2.2 基因分型检测结果

Taqman-MGB探针法检测ABCG2基因rs2231142位点SNP分型，结果如图1所示：红点表示只检测到荧光信号VIC，所测样本基因型为CC型；蓝点表示只检测到荧光型号FAM，所测样本基因型为AA型；绿点表示同时检测到荧光信号VIC和FAM，所测样本基因型为CA型。根据荧光信号分布情况，初步判断突变型AA基因型和A等位基因在原发性痛风患者中的分布频率更高。

2.3 两组基因型和等位基因型频率分布的分析

对175例痛风患者和277例健康人进行SNP分型分析，所得结果进行hardy-weinberg平衡检测，检测结果显示对照组P=0.92，符合hardy-weinberg遗传平衡，具有群体代表性。进一步分析显示(表1)，rs2231142位点CC基因型，在痛风组中分布频率为35.4%，对照组中分布频率为46.9%；CA杂合型在痛风组中分布频率为41.7%，对照组为43.0%；AA型在痛风组中分布频率为22.9%，对照组为10.1%；各基因型分布频率在痛风患者和正常人群之间差异极显著(P<0.01)。rs2231142位点等位基因A在痛风患者中的携带频率显著高于正常人群,分别为43.7%和31.6%(P<0.01),OR值为1.682(1.275～2.218)。实验结果提示：rs2231142多态性与川东北地区男性原发性痛风的发病相关，A等位基因和AA基因型为痛风发病的易感因素，C等位基因和CC型为痛风发病的保护机制。

表1 rs2231142位点基因型和等位基因型频率分布比较[n(%)]

3 讨论

2017我国痛风患者已经超过8 000万，且呈现发病率增高，发病年轻化的趋势，痛风已成为我国仅次于糖尿病的第二类代谢性疾病。痛风以男性发病为特征，男性患者占80%以上，发病年龄一般在45岁左右。痛风的发病与患者不健康的饮食习惯(高热量、高脂肪、高嘌呤食物摄入过多)和生活习惯(熬夜、不运动、不节制饮酒等)相关[10]，此外，遗传因素是原发性痛风发病的主要原因。痛风不仅引发关节损伤，痛风性关节炎反复发作可形成痛风结节和转变为慢性痛风性关节炎，并导致关节功能障碍和造成骨破坏，晚期还可能导致痛风性肾病及肾功能衰竭，最终引起死亡。痛风不仅累及关节和肾脏，而且可诱发和加重现代流行病如糖尿病、冠心病、高血压及脑血管疾病的的发生和发展，严重影响了患者的生活质量，给家庭和社会带来巨大的精神和经济负担[9-10]。探索痛风的发病机制，发现早期诊断标志和治疗靶点，对痛风的治疗至关重要。

原发性痛风与嘌呤代谢异常和尿酸排泄减少相关 ,肾脏尿酸排泄减少的相关基因包括有机阴离子转运体1(OAT1)基因、尿酸盐阴离子交换器(hURATI)基因、人葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)基因和三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)基因等[11-13]。研究表明，ABCG2主要参与肾脏尿酸的分泌，体外实验证实SNP rs2231142位点变异引起ABCG2蛋白的141位的谷氨酸(Q)变成赖氨酸(K)(Q141K)，使ABCG2蛋白多肽链的氨基酸种类和序列发生改变，引起尿酸升高，导致痛风的发生[3]。本实验以川东北地区男性原发性痛风患者为研究对象，通过Taqman-MGB探针法检测ABCG2基因 rs2231142位点多态性与痛风的关系。实验结果表明，痛风组AA基因型和A等位基因的携带率显著高于对照组，A等位基因携带者发病风险是C等位基因携带者的1.682倍，A等位基因是原发性痛风发病的危险因素。据报告，rs2231142位点A等位基因型在不同人群中的分布不同[4,14-17]，对川东北地区男性痛风患者的rs2231142位点进行SNP分型分析，对揭示该地区原发性痛风的发病机制具有重要意义，为将来拟进行的靶向药物治疗痛风筛选位点。

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