黏膜免疫及其在鸡病防控中的应用

李天芝，于新友

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

约有80%以上病原微生物主要经过呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途径侵入动物机体引起感染[1]。黏膜是防御病原微生物的第一道屏障[2]，它可在病原微生物侵入机体前将其消灭，不会对机体造成损伤，在疾病的发生和发展中起着重要的作用。黏膜免疫系统是由广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺体 （唾液腺、泪腺、乳腺）处的淋巴组织组成的系统，主要包括3部分：①黏膜相关淋巴组织，如肠黏膜相关淋巴组织、支气管黏膜相关淋巴组织、泌尿生殖道黏膜相关淋巴组织、鼻咽黏膜相关性淋巴组织和眼结膜相关淋巴组织等[3]；②致敏淋巴细胞散布途径，主要是淋巴循环及血液循环；③黏膜免疫效应部位，即全身的黏膜组织，包括胃肠道、呼吸道、眼结膜、生殖道和多种分泌腺如乳腺、唾液腺、泪腺等组织。黏膜免疫是鸡体免疫网络的重要组成部分[4]，50%以上的淋巴组织和80%的免疫细胞存在于黏膜，黏膜是鸡最大的免疫系统。黏膜免疫自诞生以来就受到国内外学者的广泛关注，成为研究的热点，黏膜免疫系统与传统意义上的免疫系统不同，不仅能在黏膜局部发挥免疫功能，产生分泌型抗体，阻止了病原微生物从黏膜的入侵，还能通过“共同黏膜免疫系统”使整个机体黏膜系统产生免疫保护[5]，同时又能诱发全身性的体液免疫应答[6]。黏膜局部的抗体比血清抗体出现得早、效价高，且维持的时间长，其抗体水平更能体现疫苗免疫保护情况。黏膜免疫产生的抗体主要以分泌型的IgA（sIgA）为主，还有分泌型的IgM（sIgM）、IgG等。随着集约化、规模化养殖业的不断发展，传统的疫苗注射免疫因存在费时费力、对鸡的应激大、操作繁琐、容易导致交叉污染等问题，已经不能完全适应生产的需要。黏膜免疫可通过气雾、口服等途径接种，简单易行、副作用较小，更重要的是可阻止病原在局部黏膜的定植，免疫效果好，不仅诱导局部免疫应答，也诱导全身性应答等，因此越来越受到关注。文章主要介绍黏膜免疫及其在鸡病防控中的应用。

1 黏膜免疫抗体

1.1 黏膜sIgA sIgA抗体是由浆细胞分化产生的，在黏膜中含量最为丰富，是参与黏膜免疫反应的主要抗体。sIgA由两个IgA单体、1条J链和一条分泌片(secretory component，SC)构成[7]，J 链是在浆细胞分泌IgA前同IgA聚合的，SC则是由IgA穿过上皮转运过程中加上的。SC无免疫活性，但它能促进上皮细胞积极地从组织中吸收sIgA，并将其释放到消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜表面，从而发挥黏膜免疫效应，还能够保护抗体免受蛋白酶的降解，增加抗体的稳定性，使其在消化道及呼吸道管腔中保持活性的时间延长。与单体IgA相比，sIgA表面具有大量的抗原结合位点，结合抗原的能力强。sIgA没有活化补体和其它促炎症因子的功能，当发挥免疫活性时只是与肠腔中的各种抗原连接，干扰它们的摄入，因此对黏膜上皮细胞的损伤较小。sIgA的作用主要是：①能捕捉进入黏膜内的病原，使病原发生凝聚，阻断其病原与黏膜结合、或与病原微生物结合形成复合物，从而阻断或阻止病原对黏膜的黏附，发挥外源病原的免疫排斥作用；②能与溶菌酶、补体共同作用引起细菌溶解，也能中和相应肠毒素的毒性；③能与吞噬细胞、自然杀伤（NK）细胞等细胞表面的Fc受体结合，发挥ADCC效应，杀伤靶细胞；④增强乳铁传递蛋白及乳过氧化物酶系统对几种黏膜病原体的抗菌作用；⑤可通过黏膜淋巴组织增强抗原依赖性细胞作用，从而提高对病原的直接杀伤能力。

1.2 黏膜sIgM sIgM是由5个IgM单体聚合而成，也是能发挥黏膜免疫功能的一种高效抗体。同sIgA的功能类似，具有抗菌、抗病毒、中和毒素的免疫活性，尤其对IgA免疫缺陷的个体，sIgM的免疫功能更为重要。

1.3 黏膜中的IgG 目前，尚不清楚血清中的IgG是如何进入分泌物中的，黏膜表面的IgG抗体在抵抗感染中可发挥重要作用。分泌到管腔中的IgG同样具有抗菌、抗病毒及抗毒素等功能。但IgG与抗原结合发挥免疫活性时，能激活补体造成黏膜上皮细胞的损伤，从而达到清除病原的作用。IgG抗体对蛋白酶的水解作用抵抗力弱，容易降解，不稳定。IgG同sIgA一样也能发挥ADCC效应，杀伤靶细胞。管腔中的IgG可与抗原结合，形成免疫复合物，返回到黏膜固有层，经树突状细胞处理后，递呈给CD4+T细胞，以供机体免疫系统识别。

2 黏膜免疫佐剂

经黏膜免疫时大多数蛋白质抗原免疫力降低，经反复大量免疫后，易引起免疫耐受，阻碍了黏膜疫苗的发展。因此，需要配合相应的佐剂，以增强黏膜免疫反应的效果，或使抗原物质免于被胃肠道消化酶的降解。黏膜免疫相关佐剂可提高疫苗的免疫原性，延长抗原与黏膜及免疫活性细胞的作用时间，减少黏膜免疫耐受，增强疫苗免疫效果[8]，是黏膜疫苗研发的重点。好的黏膜免疫佐剂需具备以下条件：①能诱导机体产生强烈的体液和/或细胞免疫应答反应；②安全性好，无热原，无致癌、致畸特性，无毒副作用，不会引起动物体的过敏反应；③稳定性好，在一定温度、pH范围，能长时间保存，性质不发生改变。目前，人们已开发出多种黏膜免疫佐剂，并投入到实际生产中，取得了一定的成果。

2.1 细菌毒素 主要包括从霍乱弧菌获得的霍乱毒素(CT)、从大肠杆菌获得的热不稳定毒素(LT)及从百日咳博德特氏菌获得的百日咳毒素等。其中，CT和LT是公认的有效的黏膜佐剂，均能提高APCs递呈抗原的能力，具有良好的免疫原性。CT和LT均由A、B两种亚单位组成的的六聚体蛋白，A亚单位具有催化ADP核糖基化的作用，B亚单位的可与与宿主细胞表面受体结合，穿透细胞，将亚单位A带入细胞。CT能诱导CD4+、Th2型细胞活化，产生 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10，也能促进IgG2b亚类、IgE和黏膜sIgA应答的出现。与抗原同时口服时可诱导CD4+、Th1细胞产生血清IgM、IgG1、IgG2a和黏膜sIgA。LT作为佐剂可与多种抗原经不同途径共免疫，均能明显增强机体对共免抗原的黏膜sIgA和IgG应答，与CT主要诱导Th2型免疫应答不同，LT诱导的应答要均衡些，产生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 和 黏膜 sIgA， 是 Th1 和Th2型应答的混合。CT和LT均具有毒性，LT的毒性较CT低，经黏膜免疫时可产生针对自身的sIgA和血清抗体，限制了其在人体上的应用。

2.2 细胞因子 细胞因子通过促进免疫活性细胞的分化增殖或影响细胞内生物活性分子的表达与分泌而发挥免疫调节作用，可直接作为佐剂使用。目前，常用的细胞因子佐剂有IL-1、IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-18及 GM-CSF 等。 IL-1和 IL-12不仅能诱导抗原特异性的免疫应答，而且诱导黏膜免疫应答。IL-1能显著增加抗体水平，尤其是IgG2a和IgA的水平，在鼻内免疫佐剂中可代替CT或LT，毒性相对较小。IL-18可诱导Th1细胞分化发育和增殖。细胞因子佐剂的缺点是半衰期短，活性易受内环境如pH、各种水解酶及血浆蛋白的影响，当大剂量的时可导致发热、炎症等副作用。

2.3 CpG基序 通过人工合成的一个或多个非甲基化的CpG基序为核心的寡核苷酸 (ODN)，也具有相似的免疫刺激功能，可诱导机体产生强烈的体液和细胞介导的全身免疫及黏膜免疫。当与蛋白抗原共同使用时，可诱导机体细胞免疫应答反应。CpG能刺激B细胞增殖，分泌多克隆抗体、IL-6、IL-12[9]，同时激活单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，促使未成熟的树突状细胞(DCs)转变为成熟的APCs。CpG作为佐剂与抗原共同免疫动物可诱发强烈的以IgG2a和CTL为主的Th1型免疫应答。还能激活T细胞、B细胞、NK细胞等，产生大量的多种细胞因子，增强机体的特异性和非特异性免疫效应。还可与传统的黏膜免疫佐剂CT和LT产生协同效应，且无毒副作用，是一种极具应用前景的黏膜免疫佐剂。

2.4 甘露聚糖 甘露聚糖可作为黏膜反应佐剂，诱导血清、阴道及唾液中sIgA的分泌。

2.5 脂质体 脂质体是由单层或多层磷脂组成的具有水相内核的环形囊状结构小体，对蛋白质或多糖抗原都有免疫增强作用。能激发细胞免疫活性，提高抗体效价，而且抗体滴度维持的时间较长。脂质体与抗原结合后可增加黏膜供给疫苗的有效性，发挥免疫佐剂效应，能诱发高水平的系统IgG和黏膜sIgA抗体反应。作为鼻黏膜免疫佐剂时，刺激机体的黏膜和全身免疫应答反应。在酸性溶液、胆汁和胰液素中非常稳定，因此，很适合作为口服疫苗的载体，脂质体也可以配合其它黏膜佐剂如CT一起使用，增加口服释放的效率。

2.6 细菌载体 应用化学或分子生物学技术使上细菌中的致病基因发生突变以降低毒性，但仍保留了其对黏膜的侵袭力或从动物体内分离的益生菌作为载体，将疫苗抗原运载至APCs。目前常用的细菌载体主要包括李斯特杆菌、鼠伤寒杆菌、志贺菌、乳酸杆菌、酵母菌等。一般通过口服方式进行免疫，可保护抗原免于被体内酸性环境破坏。

3 黏膜免疫的途径

常见的黏膜免疫途径包括消化道、呼吸道、直肠黏膜等。由于每一部位的组织结构各不相同，其免疫的分子机制和效果也不同。疫苗用量较少，又能引起强烈的全身性免疫应答反应的途径是最佳的途径[10]。下面简单介绍一下各种黏膜免疫途径的特点。

3.1 消化道 消化道免疫主要是通过口服疫苗的方式免疫，操作方便，能同时预防肠道及呼吸道、泌尿生殖道感染。是传统的黏膜免疫途径，能产生大量的sIgA发挥免疫功能，但通过消化道免疫疫苗时，疫苗容易被强烈的胃酸环境破坏，免疫时需要加大剂量，或采用特殊的物质包被，以减少胃酸对疫苗的破坏。除了sIgA发挥重要作用外，位于小肠黏膜上皮之间的上皮内淋巴细胞，直接与进入肠腔的微生物接触，也在消化道黏膜免疫中发挥重要的作用。肠道是诱导黏膜免疫应答的有效部位，经过肠道免疫可以产生较好的黏膜免疫应答，且免疫方法简单易行。如何使疫苗不受消化液的影响，使用少量的抗原有效地诱导黏膜免疫反应，提高黏膜免疫力是目前经消化道免疫急需解决的问题。

3.2 呼吸道 所谓呼吸道免疫主要是经鼻腔接种疫苗，疫苗也可通过气管，激发机体免疫。鼻黏膜具有丰富的血管，接种的疫苗能吸收进入体循环，一般所需要的剂量少，鼻腔接种后可诱导激活扁桃体处的B淋巴细胞，在鼻或扁桃体激活的部分B细胞可进入血液循环迁移到远处黏膜组织。因此，鼻腔接种疫苗不仅能预防呼吸道感染，也能预防其它部位的感染。鼻腔接种操作简单，不需要专门器械，并可避免由于注射而带来的交叉感染。

3.3 直肠 鸡直肠黏膜中有大量M细胞和淋巴细胞，直肠能够进行局部黏膜免疫。

4 黏膜免疫在鸡病防控中的应用

4.1 鸡新城疫防控 新城疫病毒(NDV)感染的门户主要是呼吸道和消化道黏膜，黏膜免疫作为鸡体免疫的第一道防线，对防止NDV感染具有重要意义。对新城疫来说，要抵抗其强毒攻击，既需要全身免疫，又需要局部免疫，特别是呼吸道的局部免疫，呼吸道的局部免疫只有直接接触外源性抗原才能引起免疫应答。唐思静等[11]以NDV LaSota株作为共免疫原，与大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白(LTRG)重组蛋白经滴鼻、口服及肌肉注射三种途径接种雏鸡，通过血清IgG抗体、HI抗体及粘膜分泌型IgA抗体水平变化，评价不同途径接种LTRG对NDV疫苗的免疫效果的影响。结果显示：①三种途径接种，LTRG均能显著增强NDV疫苗的免疫抗体水平，免疫雏鸡血清抗体和粘膜抗体水平均高于NDV疫苗单独免疫组；②LTRG对NDV疫苗免疫增强作用，以滴鼻接种最显著，二、三免后LTRG+NDV滴鼻组与NDV组血清IgG、粘膜 IgA 差异均显著 (P＜0.01、P＜0.05)，LTRG+NDV口服与NDV组血清IgG差异不显著 (P＞0.05)、粘膜 IgA差异极显著 (P＜0.01)，LTRG+NDV肌注与NDV组IgG差异不显著(P＞0.05)、粘膜IgA差异显著(P＜0.05)；③三种免疫途径比较：血清 IgG抗体水平差异均不明显(P＞0.05)，滴鼻、口服免疫可诱导雏鸡产生较高的粘膜IgA抗体、血清HI抗体。徐培军等[12]采用新城疫LaSota弱毒株经不同接种途径免疫雏鸡，然后采集气管液、血清，对新城疫抗体进行检测。结果表明：经饮水、滴鼻等免疫途径比肌肉注射免疫更好地激活黏膜免疫部位产生更高水平的抗体。黏膜免疫途径气管液中的抗体在一免后比血清中抗体效价高 (P＜0.05或 P＜0.01)，而二免后其抗体水平要低于非黏膜免疫反应血清中抗体水平(P＜0.05)。马金萍等[13]采用新城疫La Sota弱毒株疫苗经滴鼻、点眼途径免疫不同日龄雏鸡，然后采集血清、泪液和鼻洗脱液，应用血凝抑制试验 (HI)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对抗原特异性IgM、IgG和IgA或SIgA抗体水平的消长规律进行检测。结果显示，血清中IgG抗体水平最高，IgA和IgM抗体水平相对较低。免疫组血清HI效价明显高于空白对照组血清HI效价。泪液和鼻洗脱液中新城疫病毒(NDV)特异性IgM出现的最早，于免疫后第4天可检测到，并于第7天达到高峰，而后迅速下降，而NDV特异性IgG、SIgA于免疫后第7天可检测到，并于第21天达到较高水平。13日龄免疫组总抗体水平分别高于6日龄免疫组和3日龄免疫组总抗体水平，但是1日龄免疫组不能诱导呼吸道黏膜产生抗体。

4.2 鸡传染性法氏囊病防控 鸡传染性法氏囊病(IBD)是由IBD病毒(IBDV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病，接种疫苗是防制IBD的主要措施。由于IBDV主要经消化道和呼吸道等黏膜途径感染，良好的局部黏膜免疫是抵抗该病感染的重要防线，所以通过模拟病原体的自然感染途径，增强病原体最初侵入的呼吸道和消化道黏膜局部产生特异性sIgA，进而引起全身性系统免疫应答，对有效防制该病具有重要实践意义。郑世民等[14]研究表明使用免疫增强剂“禽福”和“Immunair”的1日龄SPF雏鸡接种IBD疫苗后，其消化道和呼吸道局部黏膜免疫组织的T细胞和IgA、IgM和IgG生成细胞数量指标均不同程度地高于IBD疫苗单独免疫的雏鸡，表明免疫增强剂能明显提高雏鸡消化道和呼吸道局部黏膜免疫组织对IBD疫苗的免疫应答，增强IBD免疫雏鸡对vvIBDV攻击的保护力。许信刚等[15]构建了能表达IBDV VP2基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-VP2)，进行重组菌VP2蛋白表达的鉴定，测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性以及小鼠免疫试验。结果表明，酶切鉴定证实重组质粒构建成功，SDS-PAGE和Western blot证实重组菌表达的VP2蛋白能与鸡抗IBDV阳性血清特异性结合，重组菌株在体外营养选择压力下，可稳定地携带重组质粒传代繁殖，在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏，小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用，口服重组菌免疫小鼠，ELISA检测产生了抗IBDV抗体，中和试验表明产生的抗体具有中和活性。林红丽等[16]构建了能表达IBDVVP2基因的重组干酪乳杆菌，分别口服、滴鼻/点眼pLAVP2/L.casei，口服、肌注商品活苗及口服pLA/L.casei和PBS为对照，监测IgG和sIgA抗体水平，末免后7d检测脾淋巴细胞增殖情况并攻毒，7d后剖检，观察法氏囊损伤程度并记录病变得分和保护率。结果表明，各组的特异性sIgA、IgG抗体水平显著高于对照组 (P＜0.01)，口服 pLA-VP2/L.casei组的淋巴细胞刺激指数显著高于其他组 (P＜0.01)，保护率高达83.3%，免疫保护效果优于滴鼻/点眼组。

4.3 禽流感防控 禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类传染性疾病。AIV主要通过消化道和呼吸道感染鸡，而后在肠道黏膜复制。如果增强咽和小肠黏膜免疫力，阻止病毒经消化道和呼吸道途径进入体内，控制病毒在肠道定殖复制将会直接切断病毒的传播。目前控制和预防禽流感主要依靠注射禽流感全病毒灭活疫苗(油乳剂灭活苗)，但肌肉注射灭活疫苗不能对黏膜局部产生有效刺激，也就不能诱导局部免疫应答。焦凤超等[17]构建了含H5亚型禽流感病毒HA基因的重组沙门菌SL7207(pVAX1-HA)和 X4550(asd-pVAX1-HA)，以2×109CFU的剂量两次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡，同时，将重组菌分别与pVAX1-IFN-γ或 pVAX1-IL2(200μg/只)联合免疫，通过测定小肠粘膜抗体效价，结果显示，重组菌单独免疫组和联合免疫组能激发机体产生粘膜免疫应答，且与空载体组、空白对照组以及油苗组之间存在显著性差异 (P＜0.05)。攻毒后，两组重组菌免疫组鸡对AIVH5亚型强毒攻击均具有良好的免疫保护作用。刘丽平等[18]构建了含H9N2亚型AIVHA基因的重组沙门菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asdpVAX1-HA)。以5×109cfu/只的剂量两次口服接种1日龄的商品代伊莎褐蛋鸡，免疫鸡既能检测到HA特异性的血清抗体应答，又能检测到黏膜免疫应答，采用A/Chicken/Shanghai/3/2002(H9N2)AIV毒株经滴鼻和口服同时攻毒免疫鸡后，这两种疫苗抑制免疫鸡排毒的效果与灭活疫苗有显著差异。

4.4 鸡传染性支气管炎防控 鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡传染性支气管炎(IB)是一种具有高度传染性的病毒性呼吸道疾病，主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，不同日龄均能感染，雏鸡最易感。IBV是典型的嗜黏膜病原，主要通过呼吸道黏膜途径感染机体，因此黏膜免疫研究是IBV致病机制研究的重中之重。房慧伶等[19]采用传染性支气管炎弱毒苗对1日龄雏鸡分别进行点眼和滴鼻免疫。取气管和哈德氏腺做石蜡切片，免疫组化染色，对气管和哈德氏腺中SIgA细胞的分布、数量变化进行了观察。结果表明：SIgA阳性细胞分布在哈德氏腺的间质中，气管中的SIgA细胞主要分布在黏膜上皮细胞之间和固有层中，局部黏膜上皮形成的隐窝内也分布有SIgA细胞。数量统计分析表明：免疫组的哈德氏腺和气管中SIgA细胞数量显著高于对照组，点眼免疫的SIgA细胞数量比滴鼻免疫的高，加强免疫则使SIgA细胞数量进一步增多。

4.5 鸡毒支原体防控 鸡毒支原体(MG)引起的慢性呼吸道疾病已成为我国养鸡业中一种重要的疾病，鸡群平均感染率高达80%。现有鸡毒支原体灭活疫苗的肌注免疫途径只能激活机体的体液免疫，灭活疫苗虽然能激发集体的细胞免疫，但存在毒力返强的风险。研究表明体液免疫并不能有效抵抗MG感染，而黏膜抗体(IgA)和细胞免疫可能更重要，胡思顺等[20]将表达的鸡毒支原体(MG)HS株pMGA1.2重组蛋白(rpMGA1.2)经滴鼻点眼途径免疫SPF鸡，并进行攻毒试验，结果显示，免疫的SPF鸡能够诱导产生特异性体液免疫和呼吸道粘膜免疫，对2×109ccu MG-HS攻击的保护率为67%。

5 小结与展望

黏膜免疫尤其对于一些经黏膜途径侵入动物机体的病原防控效果更好，与传统的免疫方式相比，黏膜免疫具有很多优点，对动物应激小，安全性好，即能产生局部黏膜免疫，形成黏膜抗体防护网，又能及全身免疫应答反应，操作简便，省时、省力，可发挥占位效应，适合规模化养殖场应用，是鸡用疫苗研究的重要方向。但在黏膜疫苗的研制过程中也存在一些问题，如在免疫佐剂的选择，免疫途径的确定及如何保持抗原的活性且发挥最佳的免疫效果等方面还有很多工作需要研究。黏膜佐剂的研制也取得了一定的进展，开发安全性、有效性、稳定性好的新型黏膜疫苗仍然是生物技术领域及生命科学工作者的重大挑战。相信随着分子生物学和免疫学理论与技术的发展，黏膜免疫将在今后鸡病的防控中发挥越来越重要的作用。

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