2，4-表油菜素内酯和赤霉素对微拟球藻产油率及脂肪酸组成的影响

凌婷 杨树萍 魏煜凡 张琳

（宁波大学海洋学院，宁波 315211）

改变微藻的培养条件（如氮磷硅等营养成分、pH、温度、光强等）既可调控微藻的脂肪酸组成，又可调控微藻的总脂含量［1-4］。添加植物生长调节剂也是其中一种有效手段。据报道，2，4-表油菜素内酯（2，4-Epibrassinosteroid，EBR）、赤霉素（Gibberellin A3，GA3）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、水杨酸（Salicylic acid，SA）等植物生长调节剂对促进微藻生长、优化脂肪酸组成、增加抗逆性等有显著功效［5］。该结论在小球藻（Chlorella sp.）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）等微藻中得以印证［6］。微拟球藻（Nannochloropsis sp.），属于真眼点藻纲（Eustigmatophyceae），是一类具有巨大开发潜力的经济微藻。其富含多糖、蛋白和多不饱和脂肪酸（PUFAs）等高附加值产物，被广泛用作水产饵料及心脏病、糖尿病等疾病的预防［7］。此外，微拟球藻油脂含量高，被视为最有发展前景的生物柴油原材料之一［8］。

目前，植物生长调节剂对微拟球藻产油率及脂肪酸组成影响的研究较少，本实验着重分析了EBR、GA3对微拟球藻大洋种（Nannochloropsis oceanica）生长、产油率和脂肪酸组成的影响，拟找出最适浓度，为微拟球藻的研究和应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

微拟球藻藻种编号为N. oceanica LAMB0001，由中国海洋大学应用微藻生物学实验室提供。培养基选用f/2海水培养基［9］。培养温度（24±1）℃，光 周 期（L∶D）12 h∶12 h， 光 照 强 度 60 μmol photons/（m2·s）。每天固定时间摇瓶4次，防止细胞贴壁。EBR和GA3购自美国Sigma公司，使用微孔膜过滤除菌配制成母液，低温保存。

1.2 方法

1.2.1 实验流程 将微拟球藻培养至指数生长中期，分别取60 mL接种于新鲜f/2培养基中至总体积300mL，并分别添加EBR和GA3至相应的终浓度。EBR和GA3分别设置4个浓度梯度0、5、15和50 mg/L，每个浓度设置3个平行。培养10 d，收集细胞，测定干重、脂肪酸组成及总脂含量。期间，每天监测藻液光密度变化。

1.2.2 光密度及干重测定 光密度测定方法：本实验使用750 nm波长下藻液的吸光度来表示藻液光密度。光密度值代表细胞密度。干重测定方法：离心收集一定体积的藻液，冷冻干燥后称取藻粉重量。

1.2.3 总脂含量测定分析 取30 mg冷冻干燥的藻粉至密封性良好的螺口玻璃管中，加入氯仿-甲醇（体积比2∶1）剧烈震荡15 min，离心（4 000 r/min，10 min）后吸取上清液至新的螺口玻璃管中。重复抽提3次。向装有上清液的玻璃管中加入适量NaCl溶液（0.9%），充分震荡混匀，静置30 min。吸取下层有机相至新玻璃管中，50℃水浴待氯仿全部挥发，称重并计算总脂含量。

1.2.4 脂肪酸组成测定分析 取20 mg冷冻干燥的藻粉置于密封性良好的螺口玻璃管中，加入2 mL KOH-CH3OH溶液（2 mol/L）于75℃水浴锅中皂化和甲酯化30 min；冷却至室温后加入2 mL HCl-CH3OH溶液（3 mol/L），75℃水浴酸化30 min；冷却后再加入1 mL色谱级正己烷和适量蒸馏水，充分震荡促进分层；吸取正己烷相待测。

脂肪酸组成分析：采用Agilent 6890 Series GC System 气相色谱仪（US10251016，USA），色谱柱为 HP-5毛 细 管 柱（30 m×320 μm×0.25 μm，5%Phenyl Siloxane），检测器为氢火焰离子化检测器（FID）。使用安捷伦化学工作站数据处理系统（Agilent Chemsation）分析结果，以面积归一化法计算脂肪酸组分的相对百分含量。

2 结果

2.1 EBR和GA3对生长的影响

添加不同浓度EBR的微拟球藻生长状况如图1所示。曲线使用Origin 7.0软件非线性拟合得到，光密度值代表细胞密度，曲线斜率变化代表生长速率。当EBR浓度小于15 mg/L时，随着EBR浓度升高，微拟球藻对数生长期不断延长。培养至第10天，15 mg/L EBR处理组光密度较5 mg/L处理组和对照组分别提高了6.44%和17.45%。由此可见，15 mg/L EBR对其生长促进最明显。而50 mg/L EBR对微拟球藻生长产生了抑制作用，培养仅至第4天，光密度就下降至初始值的47%，显微观察发现藻细胞已裂解。

与EBR不同，较对照组，本实验中所设3种浓度的GA3均能促进微拟球藻生长，对数生长期延长（图2）。培养10 d后，添加了5、15和50 mg/L GA3的处理组光密度分别比对照组高出 14.54%，17.51%和29.28%；50 mg/L GA3处理下光密度达到最大。说明GA3对微拟球藻的细胞增殖十分有效。

图1 不同浓度EBR对微拟球藻藻液光密度的影响

2.2 EBR和GA3对生物量、总脂含量及产油率的影响

本实验所设50 mg/L EBR显著抑制微拟球藻生长，藻液浓度过低，以致无法收集测定后续指标。如表1所示，添加较低浓度（5、15 mg/L）的EBR后，该藻生物量较对照组显著增加，分别增加了9.19%、13.97%，而总脂含量并未发生显著变化。综合生物量和总脂含量来看，添加5和15 mg/L EBR后该藻产油率较对照组分别增加了7.85%和13.97%。生物量增幅与产油率增幅相近，由此推测EBR对微拟球藻产油率的提高主要归功于其对该藻生物量积累的促进，并不影响单位质量藻细胞的总脂含量。

图2 不同浓度GA3对微拟球藻液光密度的影响

表1 EBR和GA3对微拟球藻生物量及总脂含量的影响

由表1可知，在实验浓度范围内，GA3处理组微拟球藻生物量较对照组显著提高，且随GA3浓度增加而增加；当GA3为50 mg/L时，生物量最高达0.337 g/L。而总脂含量与之不同，5、15、50 mg/L处理组较对照组均没有显著变化。综合生物量和总脂含量分析，产油率在GA3为15 mg/L时达到最大值（8.184 mg/（L·d）），显著高于对照组及5和50mg/L处理组。以上结果表明，实验所设浓度GA3均显著促进了微拟球藻生物量的积累，而对总脂含量影响不大。产油率的差异主要是来自GA3对微拟球藻生长的影响。总体来看，15 mg/L GA3对产油率提高效果最显著。

2.3 EBR和GA3对脂肪酸组成的影响

不同浓度EBR和GA3对微拟球藻脂肪酸组成的影响如表2和表3所示。与对照相比，不同浓度的EBR和GA3对14∶0（十四烷酸，其中14代表脂肪酸碳链长度，0代表双键的数量；以此类推）所占比例基本无影响，16∶0、16∶1、18∶1所占比例随着EBR和GA3浓度升高而显著降低，而18∶2、20∶4、20∶5（EPA）所占比例显著提高。特别是EPA含量显著提高，培养仅10 d，15和50 mg/L GA3处理组中其含量即分别达到了34.96%和36.34%。

表2 EBR浓度对微拟球藻脂肪酸组成的影响

表3 GA3浓度对微拟球藻脂肪酸组成的影响

3 讨论

3.1 EBR和GA3对微拟球藻生长的影响

EBR是一种广谱、无毒的高活性植物激素，其最突出的作用是促进细胞伸长与分裂、促进植物光合作用及增加植物抗逆性［10-12］。范新照等［13］认为2 μmol/L EBR即可显著促进微茫藻（Micractinium sp.）生长；而10 μmol/L EBR则显著抑制其生长，最大生物量较对照组减少了72.83%。王小飞等［14］研究表明，在0-0.2 mg/L范围内，随EBR浓度升高，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）生物量呈先增后减之趋势。本实验发现，在5、15 mg/L时，EBR显著促进微拟球藻生长；而50 mg/L EBR则会抑制该藻生长。这与前人研究结果相似，但因不同藻种对EBR敏感性有差异，其最适作用浓度也不同。

GA3是重要的植物激素之一，其主要作用是促进细胞分裂。Falkowska等［15］研究了GA3对镉铅胁迫条件下普通小球藻（Chlorella vulgaris）的影响，结果表明，GA3可促进细胞增殖和光合色素及单糖的积累。Park等［16］发现，1 mg/L GA3对莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）生长促进效果最显著。范新照等［13］使用GA3处理微茫藻后发现，1 μmol/L GA3对藻株生长有明显促进作用；增加GA3浓度至5 μmol/L 则会显著抑制该藻生长，其最大生物量比对照组减少了60.70%。据报道，在一定浓度范围（0.01-10 mg/L）内，随GA3浓度升高，其对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）生长促进越明显；浓度过高则会抑制其生长［17］。在本实验浓度范围内，GA3对微拟球藻生长促进效果也随GA3浓度增大而增强，这与低浓度EBR在其他藻中的作用效果相似。但本实验中浓度尚未达到抑制微拟球藻生长的临界值，更高浓度GA3的作用效果有待后期探索。

3.2 EBR和GA3对微拟球藻总脂含量及产油率的影响

除调节微藻生长外，适宜浓度EBR和GA3对其总脂含量也有显著影响。郝宗娣等［6］研究表明，EBR能显著提高原始小球藻（Chlorella protothecoides）的总脂含量。王小飞等［14］认为0.1 mg/L EBR能显著提高三角褐指藻的产量和总脂含量。本实验发现，EBR处理下的微拟球藻产油率和生物量是同步增加的，而单位质量藻细胞的总脂百分含量并未发生明显改变，推测EBR提高微拟球藻产油率是通过促进其细胞增殖实现的。

目前，GA3对微藻总脂含量影响的研究较少。据报道，1.0 μmol/L GA3处理下，微茫藻油脂含量较对照组有所降低；GA3浓度为5.0 μmol/L 时，其生物量降低但油脂含量却显著提高［13］。在本研究中，50 mg/L GA3虽促进了微拟球藻生物量积累，但显著抑制了单位质量藻细胞的总脂含量，而15 mg/L GA3处理下总脂含量和产油率达到最高，效果较好，且优于EBR处理组的效果。综上，适宜浓度GA3对于促进该藻生长、总脂积累作用显著。

3.3 EBR和GA3对微拟球藻脂肪酸组成的影响

多不饱和脂肪酸是形成生物膜的必备条件之一，在维持生物膜流动性中起关键作用［18］。此外，参与多个重要生理过程，如物质转运［19］和叶绿体形成［20］等。本实验中，添加EBR（5和15 mg/L）和GA3（5、15和50 mg/L）后，微拟球藻中饱和及单不饱和脂肪酸（16∶0、16∶1、18∶1）占比随浓度升高而逐渐下降，多不饱和脂肪酸（18∶2、20∶4、20∶5）占比则显著提高。培养10 d后，15和50 mg/L GA3处理组中EPA含量即分别达到了34.96%和36.34%。结果表明，一定浓度EBR和GA3可促进微拟球藻生长和油脂积累并优化其脂肪酸组成。EPA属于ω3系长链多不饱和脂肪酸，具有维持生物膜的结构和功能、预防心脑血管疾病、提高机体免疫力和改善视力等功效［21］。作为EPA主要来源，现有鱼油难以满足人们的持续需求［22］，微拟球藻作为一类重要的经济微藻，在EPA生产上潜力巨大。

4 结论

本研究发现，5、15 mg/L EBR能显著促进微拟球藻生长和提高其产油率，但对单位质量藻细胞总脂含量影响不大。50 mg/L EBR则显著抑制该藻生长。5、15和50 mg/L GA3均显著促进微拟球藻生物量积累。15 mg/L GA3对微拟球藻产油率提升效果最显著。50 mg/L GA3处理组生物量最高，但总脂积累受到一定抑制。添加EBR和GA3浓度后，饱和和单不饱和脂肪酸占比下降，多不饱和脂肪酸占比显著提高。

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