基于尼罗红染色分析金藻总脂动态积累

周文俊 郑 立 韩笑天 郑明刚 张魁英 高 伟 崔志松



基于尼罗红染色分析金藻总脂动态积累

周文俊1郑 立1韩笑天2郑明刚1张魁英1高 伟1崔志松1

(1. 国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心, 青岛 266061; 2. 中国科学院海洋研究所海洋环境科学重点实验室, 青岛 266060)

通过尼罗红荧光染色对一株富油微藻金藻sp.CCMM5001建立和完善了一种方便快捷且能准确定量金藻油脂含量的方法, 利用该方法探索了不同培养条件对金藻生长和总脂积累的影响。结果表明: 经尼罗红染色后, 金藻的单细胞荧光强度与其总脂含量呈良好的线性关系; 金藻最适生长的氮浓度、光照强度和温度分别为1323 µmol/L、148.0 µmol/(m2·s)、25℃; 最适总脂积累的氮浓度、光照强度和温度分别为441 µmol/L、92.5 µmol/(m2·s)、15℃; 优化培养条件并采用两阶段培养法后总脂含量和油脂产率都有大幅提高, 可分别高达63.3%和22 mg/(L·d)。

金藻; 尼罗红; 总脂; 荧光强度; 生长曲线

近年来, 生物柴油因其来源广泛、燃烧性能高、对环境污染低以及可再生等优点而成为研究热点。目前国际上主要以大豆、油菜籽、蓖麻籽、棕榈种子以及动物脂肪等为原料生产生物柴油[1—3], 但这些原料尚不能满足当前经济发展对生物柴油的需求, 同时因其与粮食作物争用耕地而可能导致世界粮食供应问题[4], 对此, 科研人员提出用高油脂含量的微藻来替代传统油料作物生产生物柴油[4—6]。以微藻为原料生产的生物柴油具有清洁环保、燃烧性能好以及可再生等优点, 一些微藻如[7]、sp.[8]、[9]、[10]和[11]等已被报道可以高效地生产优质的生物柴油。尽管如此, 这类适合应用于生产生物柴油的微藻种类还很有限, 而如何快速有效地从大量的微藻种类中筛选高油脂含量的藻种, 并根据其油脂积累特点优化培养条件以获得最高的油脂产率一直是微藻生物柴油研究需要解决的难题。传统的油脂提取方法要预先收集足量的藻体并进行冻干、研磨、反复萃取、离心以及旋转蒸发等一系列繁琐的步骤[12], 这不仅耗时耗力, 并且需要使用大量三氯甲烷和甲醇等化学试剂。因此, 亟待建立和完善一种方便快捷且能准确定量检测微藻油脂含量的方法。

尼罗红是一种具有较强荧光特性的疏水性染料,它可与脂类物质结合, 在特定波长的激发下发出强烈的橙黄色或红色荧光, 但在水溶剂中, 其荧光性完全淬灭。目前, 尼罗红已被广泛应用于对哺乳动物细胞、浮游动物、酵母菌以及微藻等的油脂进行定性观察和原位检测[13—16]。研究发现, 激发波长和散射波长分别为450—500 nm和>528 nm时, 经尼罗红染色的微藻细胞荧光强度(Fluorescence intensity, FI)与细胞内油脂(中性脂)含量显著相关[17—19]。因此, 可通过即时测定荧光强度的大小来原位检测微藻的油脂含量, 从而了解其油脂积累规律并确定最佳培养条件和收获周期。与传统的油脂含量测定方法相比, 尼罗红法操作简单, 所需微藻生物量小, 并且允许同时处理大批量的样品。但研究也表明, 并非所有微藻都可被尼罗红染色, 所以该方法只能针对合适的藻种开展油脂含量的测定研究。

经本实验室前期的培育和研究发现, 实验室筛选的一株金藻sp.CCMM5001细胞内含有丰富的油脂资源, 其总脂含量可高达藻细胞干重的40%, 且适合制备生物柴油的C14-C18系脂肪酸含量为总脂肪酸含量的80%以上, 表现出作为一种生产生物柴油候选藻种的优良特性, 但其油脂积累的动态规律及具有最高油脂产率的最佳培养条件还需进一步研究。值得一提的是该金藻无细胞壁, 极易被染色材料着色, 但利用尼罗红对其进行染色所开展的油脂含量的测定研究还未见报道。

本文拟通过尼罗红染色法建立一种方便快捷且能准确定量微藻油脂含量的方法, 并利用该方法探讨不同氮浓度、光照强度和温度培养条件下金藻的油脂动态积累过程, 从而确定其生产油脂的最佳培养条件, 为进一步对金藻进行大规模培养以生产优质的生物柴油奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 微藻来源及其培养

实验藻株金藻sp.CCMM5001由中国科学院海洋研究所提供, 培养使用f/2培养液配方[20], 光照强度92.5 µmol/(m2·s), 光暗比16h︰8h, 温度(25±1)℃。

1.2 仪器与试剂

多功能酶标仪(Tecan Infinite M200)、倒置荧光显微镜(Nikon ECLIPSE TE2000-U)、气相色谱-质谱仪(Agilent GC7890A-MS5975C)。尼罗红(Nile Red)购自J & K Scientific公司, 以丙酮为溶剂配制成 0.1 g/L母液, 于–20℃避光保存。

1.3 实验方法

微藻的尼罗红染色 用血球计数板法测定藻细胞密度, 取1 mL细胞密度约为1×106cells/mL的藻液于小试管中, 添加0.01 mL尼罗红母液使其终浓度为1 mg/L, 振荡混匀, 于20℃避光染色10min, 用倒置荧光显微镜(蓝光激发)观察藻细胞内被染色油脂; 取96孔板, 每孔加入200 µL染色藻液, 用多功能酶标仪检测激发波长为480 nm时藻液在580 nm处的荧光强度, 并扣除未染色藻液在该波长处的荧光强度即为净荧光值, 染色处理组和空白对照组均设置3个平行, 重复测定3次。

单细胞荧光值和油脂含量关系的建立 在1.1培养条件下于不同生长阶段分别测定藻液荧光强度和细胞密度, 并离心收集藻体, 冷冻干燥至恒重, 取0.1 g干藻粉采用三氯甲烷-甲醇提取法测定总脂含量(%细胞干重)。将单细胞荧光强度和总脂含量进行线性拟合获得二者线性关系。

不同培养条件下油脂动态积累的检测 不同氮浓度(以硝酸钠为氮源)、光照强度、温度等培养条件列于表1中, 其他培养条件同1.1。将处于指数生长期的藻液按照10%的接种量分别接种到不同培养条件的f/2海水培养基中, 每隔一天测定藻细胞密度和荧光强度, 并由上述所得线性关系计算总脂含量。

表1 金藻Isochrysis sp.CCMM5001的不同培养条件

油脂产率的计算与脂肪酸组成的分析 取100 mL藻液, 抽滤于事先称重的0.45 µm滤膜上, 冷冻干燥后称重, 并根据上述步骤中所得相应的总脂含量进行计算即可获得油脂产率。将干藻粉用三氯甲烷-甲醇溶液进行提取, 经过皂化和甲酯化处理后用气相色谱-质谱仪进行脂肪酸组成分析, 色谱柱型号为HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 µm)。气相色谱条件: 载气为氦气, 流速为1 mL/min, 进样口温度280℃, 传输线温度为280℃; 升温程序为: 初温50℃, 保持2min, 以6℃/min升到300℃, 保持15min; 不分流进样, 进样量1 µL。质谱条件: 离子源为EI, 倍增器电压1200V, 离子源温度为230℃, 四级杆温度150℃, Scan方式检测。

1.4 数据统计

每组实验设置3个平行, 取平均值作为实验结果(Mean±SD)。用OriginPro 7.5软件进行统计分析。

2 结果

2.1 微藻尼罗红染色镜检结果与单细胞荧光值-总脂含量线性关系

将染色后的藻液用蓝光激发于荧光显微镜下进行观察(图1), 藻细胞整体呈红色, 细胞内被染色油脂体呈明亮的黄色。经观察发现, 藻细胞内油脂体的大小和数目随藻液所处生长阶段的不同而有所差异。处于对数生长期的藻细胞其油脂体形状较小, 直径约为0.5 µm, 且数目较少。进入稳定期后油脂体逐渐变大, 直径可达1 µm左右, 数目亦有所增加。

图1 金藻Isochrysis sp.CCMM5001经尼罗红染色后的荧光显微镜镜检图

由以上观察结果可知, 金藻在不同的生长阶段其油脂含量有所不同, 经尼罗红染色后的荧光强度也随之发生变化。为确定总脂含量与荧光强度之间的关系, 用三氯甲烷-甲醇提取法测定不同生长阶段微藻的总脂含量, 并将其与相应的单细胞荧光值进行线性拟合, 可获得如图2所示线性拟合图(2= 0.9572), 油脂含量与单细胞荧光强度具有良好的线性相关性, 单细胞荧光值随着油脂含量的增加而增大。

2.2 在不同培养条件下微藻生长曲线与总脂动态积累

实验测定了不同氮浓度、光照强度以及温度培养条件下金藻的生长曲线以及不同生长阶段尼罗红染色的单细胞荧光强度, 并根据2.1中所得线性关系, 获得了微藻总脂的动态积累过程。

在不同氮浓度培养条件下, 金藻的生长状况和总脂动态积累过程均受显著影响。当氮浓度≤1323 µmol/L时, 藻细胞密度随着氮浓度的增加而增大, 并在1323 µmol/L培养11d时获得最大藻密度2.7×107cells/mL; 当氮浓度继续增加到1764 µmol/L时, 藻细胞密度大幅降低(图3A)。微藻总脂主要在对数生长期后期以及稳定期积累, 随着氮浓度从 441 µmol/L增加到1764 µmol/L, 总脂含量逐渐降低, 在培养13d时882 µmol/L的氮浓度可获得最高总脂含量51.2%; 另外, 不同氮浓度的总脂主要积累期随氮浓度的增加而依次有所延后, 即随着藻密度的增加, 氮逐渐被消耗到较低水平时总脂开始积累(图3B)。

图2 单细胞荧光值与总脂含量的线性关系(R2 = 0.9572)

光照强度对金藻的生长有较大影响, 但对其总脂的积累影响较小。当光照强度过低[37 µmol/(m2·s)]或过高[148 µmol/(m2·s)]时均不利于微藻的生长, 但随着藻密度的增加, 藻液透光度降低, 此时高光照强度下的藻密度迅速增大并可获得最大藻密度2.6×107cells/mL (图4A)。光照强度对总脂的含量影响较小, 高光照强度时的油脂含量略低于中、低光照强度时的油脂含量(图4B)。

温度对金藻的生长状况和总脂动态积累过程具有显著影响。当温度过低(15℃)或过高(35℃)时, 微藻生长缓慢, 可获得的最大藻细胞密度也远低于25℃培养条件下的藻密度2.4×107cells/mL (图5A)。微藻总脂含量随着温度的升高逐渐降低, 当温度为15℃时总脂迅速积累, 并在培养7d时即可获得最大的总脂含量50.8% (图5B)。

由微藻总脂的积累趋势可以看出, 不同培养条件下稳定期的总脂含量均比对数期时有所增加, 但并未像尼罗红染色镜检时油滴的数目和大小所增加的那样大幅提高, 这可能是因为藻细胞内所含总脂除了以油滴形态存在外, 还以溶解态以及与膜结合的形式等存在。

图3 不同氮浓度对金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生长曲线(A)和总脂积累(B)的影响

2.3 微藻培养条件的优化与结果检测

由2.2中培养结果可知, 当氮浓度为1323 µmol/L时金藻生长最快, 收获时藻密度最大, 但总脂含量并非最高; 培养初期以92.5 µmol/(m2·s)的光照强度进行培养, 当藻密度达到约1×107cells/mL时适度提高光照强度有利于收获更高的藻生物量; 25℃培养时有利于微藻生长, 但总脂积累较缓慢, 15℃培养时总脂积累迅速且含量较高, 但生长缓慢, 所以可先于25℃下培养一段时间获得一定生物量之后再于15℃下培养5—7d使其总脂得到积累。

为尽可能收获较高的生物量与总脂含量, 根据金藻在不同培养条件下的生长特征和总脂积累特点, 实验设计了两阶段培养法对其进行培养(表2)。

对两阶段培养的金藻的藻密度和总脂含量进行检测(图6), 将其与常规培养条件[氮浓度1323 µmol/L,光照强度92.5 µmol/(m2·s), 温度25℃]下的金藻进行比较, 可以看出: 由于温度的降低, 第二阶段微藻的生长略有减缓, 但最终所能收获的最大细胞密度亦可高达2.5×107cells/mL; 在第二阶段, 总脂迅速积累, 培养11d时总脂含量可高达63.3%, 远高于常规培养时所能达到的最大总脂含量44.2%。将两阶段培养法所能获得的最大油脂产率和其他不同培养条件下所能获得的最大油脂产率进行对比(图7), 可以看出: 当氮浓度为882 µmol/L时可获得最高油脂产率, 氮浓度继续增大时油脂产率反而降低; 油脂产率随光照强度的增大而增大, 当光照强度≥92.5 µmol/(m2·s)时油脂产率不再明显增大; 当温度为25℃时可获得最高油脂产率, 温度过高或过低都会降低油脂产率; 在未进行培养条件优化前, 金藻的油脂产率普遍在15 mg/(L·d)左右, 经过优化并采用两阶段培养法后其油脂产率大幅提高45%以上, 可高达22 mg/(L·d)。为确定经条件优化后的金藻的油脂成分是否仍具有生产生物柴油的优良特性, 实验利用GC-MS进一步分析研究了其脂肪酸组成。结果显示(表3), 相比常规培养时的脂肪酸组成, 优化的两阶段培养法所含的C14:0、C16:0等饱和脂肪酸含量有所降低, C18:1等不饱和脂肪酸含量有所增加, C14-C18系脂肪酸含量并无明显变化, 均可高达总脂肪酸的88%以上, 保持了其生产生物柴油的优良特性。另外, 不饱和脂肪酸总含量的显著提高也增加了金藻对保健品开发利用的附加产值。

图4 不同光照强度对金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生长曲线(A)和总脂积累(B)的影响

图5 不同温度对金藻Isochrysis sp.CCMM5001的生长曲线(A)和总脂积累(B)的影响

图6 普通培养法和两阶段培养法对金藻Isochrysis sp.CCMM5001生长曲线和总脂积累的影响对比

表2 金藻Isochrysis sp.CCMM5001两阶段培养法的培养条件

3 讨论

3.1 微藻的尼罗红荧光染色

本实验利用尼罗红对金藻进行染色并测定其荧光强度, 发现该荧光强度与藻细胞内总脂含量呈线性关系, 这与Alonzo和Mayzaud[13]对浮游动物的脂类进行染色后发现其荧光强度与脂类浓度呈线性关系的结果类似。尼罗红染色受诸多因素影响, 如尼罗红浓度、染色时间以及藻细胞密度等[17]。Chen,.的研究结果表明, 尼罗红的终浓度在0.25—2 mg/L之间时, 染色效果较佳, 染色时间则以10min最佳[21]。本研究在之前进行的预实验中发现, 实验藻株金藻的藻细胞密度在一定范围内(0—1.075×107cells/mL)与其荧光强度具有良好的线性关系(2=0.9912), 当藻密度大于1.075×107cells/mL时荧光强度逐渐降低(图8)。并不是所有微藻都适用于尼罗红染色, 因为大多数微藻细胞具有细胞壁, 限制了尼罗红进入藻细胞与脂类结合产生荧光, 如Chen,.对劳氏角毛藻()、赫氏圆石藻()、寇氏隐甲藻()、微绿球藻(sp.)以及小球藻(sp.)等藻类进行尼罗红染色时发现具有细胞壁的藻细胞很难被有效染色, 而在经过液氮研磨、高温、甲醇、DMSO、丙酮、乙醇以及异丙醇等各种处理之后藻细胞荧光强度有所增强, 其中以25%的DMSO处理效果最好[21]。本实验所用的金藻不具有细胞壁, 因此可以直接被尼罗红染色。

图7 不同培养条件下金藻Isochrysis sp.CCMM5001的油脂产率

表3 普通培养法和两阶段培养法对金藻Isochrysis sp.CCMM5001主要脂肪酸组成的影响对比

图8 金藻Isochrysis sp.CCMM5001藻细胞密度对荧光强度的影响

以往尼罗红对微藻染色的研究只限于通过荧光强度的大小来定性或粗略地描述脂类的相对含量[17—19, 22], 而未见对其绝对含量进行研究的报道。本论文在建立单细胞荧光值与总脂含量线性关系的基础上, 通过简单的计算即可获得微藻在不同培养条件下不同生长阶段时总脂的绝对含量, 与传统的测定绝对含量的化学提取法相比, 该方法操作简单、所需样品量少(化学提取法需0.2 g干藻粉), 并可即时监测总脂的动态积累过程, 另外, 多功能酶标仪和96孔板在实验中的应用也使得同时处理大批量的样品变得快速可行。

3.2 微藻培养条件的优化

本实验研究了不同氮浓度、光照强度以及温度培养条件下金藻的生长状况和总脂动态积累过程, 并优化了培养条件使其具有最高的油脂产率。研究结果表明, 金藻的细胞密度在一定的氮浓度范围内随氮浓度的增加而提高, 这与王学魁等和尹翠玲等的研究结果一致[23, 24]; 当氮浓度继续增加时细胞密度反而降低, 这可能是由于氮的增加改变了培养液的N/P比, 从而限制了藻细胞的生长。光照强度对微藻生长的影响表现为光照过强或过弱都将限制微藻的生长, 但随着藻密度的增加藻液透光性降低, 适当增大光照强度更有利于微藻生长。温度是另一个影响微藻生长的重要因素, 一般而言, 低温时微藻生命活动不活跃, 生长迟缓, 温度较高时则生长旺盛, 本研究表明金藻sp.CCMM5001的最佳生长温度为25℃。

不同培养条件对金藻总脂的积累也有明显的影响。王学魁等认为金藻的总脂含量随氮浓度的增加而提高[23], 但本实验的研究结果与其相反, 这可能是氮缺乏导致其他代谢路径的改变, 从而促进了细胞脂质的合成[25]。孙利芹和杨林涛报道称金藻在高光照条件下总脂含量会相对提高[26], 但本研究结果显示高光照强度[148 µmol/(m2·s)]条件下反而不利用总脂的积累, 这可能是因为在培养后期高光照强度条件下的微藻仍处于活跃分裂状态, 蛋白质和色素等物质的含量相对较高, 而作为储能物质的脂类含量则相对较低。温度对微藻总脂积累的影响表现为: 低温有利于总脂尤其是不饱和脂肪酸的积累, 而高温时总脂含量则相对较低[27—29], 本研究表明金藻sp.CCMM5001的最佳总脂积累温度为15℃。

从实验结果可以看出, 微藻最佳生长条件与最佳总脂积累条件并不相符。为了获取较高的油脂产出, 本实验首次采用两阶段培养法对金藻sp.CCMM5001进行培养, 即先在最适生长条件下培养一段时间以获得较大生物量然后调节至最适总脂积累条件以获得较高的总脂含量, 从而大幅提高了其油脂产率。

4 结论

本实验利用尼罗红染色法研究发现了金藻sp.CCMM5001的单细胞荧光强度与其总脂含量具有良好的线性关系, 并通过该方法探索了不同培养条件对金藻生长和总脂积累的影响。结果表明, 最适金藻sp.CCMM5001生长和总脂积累的氮浓度、光照强度以及温度分别为: 1323 µmol/L、148.0 µmol/(m2·s)、25℃和441 µmol/L、92.5 µmol/(m2·s)、15℃。采用两阶段培养法后总脂含量和油脂产率都大幅提高, 可分别高达63.3%和22 mg/(L·d)。

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Research on the dynamic accumulation of lipids insp. CCMM5001 based on the lipid analysis by Nile Red method

Zhou Wen-jun1, Zheng Li1, Han Xiao-tian2, Zheng Ming-gang1, Zhang Kui-ying1, Gao Wei1and Cui Zhi-song1

(1. Research Center for Marine Ecology, the First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China; 2. Key Laboratory of Marine Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266060, China)

Some species of microalgae are considered as an ideal resource for biodiesel production because they contain high level of lipids. The traditional method to quantify the lipids level includes the solvent extraction and gravimetric determination based on a chloroform-methanol-water system. This method has the disadvantage of being time consuming and inefficient. Here we used Nile Red, a lipid-soluble fluorescent probe, to establish a novel method to determinate the level of lipids in microalgae rapidly and accurately. We applied the Nile Red method to investigate the dynamic accumulation of lipids insp.CCMM5001 under different culture conditions. The results showed that there was a linear correlation between the lipids level and the cellular fluorescence of stained microalgal cells, therefore the former can be accurately indicated by the latter. Low nitrogen concentrations and low temperatures were suitable for accumulating of lipids. The level of lipids was reduced if the illumination intensity was overly high or low. On one hand the optimal conditions for the growth were: N concentration at 1323 µmol/L, illumination intensity at 148.0 µmol/(m2·s), and the temperature at 25℃. On the other hand for the maximal accumulation of the lipids, the optimal values of the parameters above were 441 µmol/L, 92.5 µmol/(m2·s), and 15℃ respectively. The culture condition was optimized and a two-stage cultivation was carried out to increase both the level and the production rate of lipids, the former reaching a high concentration of 63.3% and the latter reaching 22 mg/(L·d).

sp; Nile red; Total lipicls; Fluoresence intensity; Growth Curve

2013-01-21;

2013-12-16

海洋公益性行业专项项目(200805039); 海洋可再生能源专项(GHME2001SW02); 国家自然科学基金(41076108, 41106148, 30870247); 山东省科技发展计划(2011GHY11533)资助

周文俊(1987—), 男, 甘肃武威人; 硕士; 主要从事海洋微藻生物燃料的研究。E-mail: 86zwj@163.com

郑立, 副研究员, 博士; E-mail：zhengli@fio.org.cn

Q949.2; Q-33

A

1000-3207(2014)02-0312-08

10.7541/2014.45