Hedgehog信号通路抑制剂对转化生长因子-β1诱导人胆管癌细胞生物学行为的影响

曲义坤 国麟祺 陈 刚 徐 剑 程卓鑫

(佳木斯大学附属第一医院普外科，黑龙江 佳木斯 154000)

胆管癌侵袭能力及转移能力都很强，在早期就容易发生远处转移〔1〕。目前治疗此疾病的最有效方法是根治性手术，但大多数患者就诊时便失去了手术的机会。与此同时，胆管癌对放化疗不敏感，因此，临床上患者的5年生存率较低，且预后较差〔2〕。有学者提出，胆管细胞发生上皮间质转换(EMT)是其侵袭转移前的主要步骤，而转化生长因子(TGF)-β1因子是诱发EMT形成的最主要的因素〔3〕。本研究分析Hedgehog信号通路抑制剂对TGF-β1诱导人胆管癌细胞(RBE)生物学行为的影响。

1 资料与方法

1.1材料与试剂 肝胆管癌细胞(中国科学院上海细胞库)、Hedgehog信号通路信号抑制剂环杷明(Selleckchem)、TGF-β1诱导剂(Selleckchem)、RPMI1640(Transgenbiotech)、优质的胎牛血清(HyClone)

1.2细胞培养 将购买的10%新鲜的胎牛血清融入RPMI1640培养基，而后对人胆管癌细胞(RBE)进行接种，待接种完全后，将培养基放入培养箱中进行培养，培养环境要求温度设定为37℃，CO2的浓度为5%，保持周围环境的清洁。细胞培养期间一旦发现细胞死亡，立即停止实验，并重新开始。当细胞处于成对数生长期时，选取细胞进行实验，并用TGF-β1诱导RBE细胞增殖。

1.3加入环杷明溶液，并对其行细胞计数法检测 对上述收集的细胞进行观察，确定选择细胞健康存活且处于呈对数生长期。将其接种于6孔板上，其密度要求为1×104/cm2。此时，配置5、10、15、20、40 μmol/L的不同浓度的环杷明溶液。观察细胞生长情况，待到融合度为75%左右，加入不同浓度的环杷明溶液。随后用胰酶处理6孔板内的细胞，并选用台盼蓝进行染色处理，根据所显现的颜色，进行计数，随后计算活细胞率。而后，选择浓度为20 μmol/L的环杷明溶液为不变量，将培养时间为可变量，分别为1、2、3 d，随后采用上述方法，计算活细胞比率。

1.4检测环杷明溶液对RBE活性的影响 首先，先用胰酶处理细胞，将其制作成细胞悬浊液，浓度要求为5.5×107/L，随后接种至含96的孔板上。加入不同浓度的环杷明溶液，操作同1.3。将不加入环杷明溶液的一组作为空白对照组进行实验，其余操作同实验组。选用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5二苯基四氮唑嗅盐(MTT)法来检测Hedgehog信号通路抑制剂环杷明对REB的活力影响。随后选用MTT法检测环杷明对REB增殖的影响，以抑制率为指标进行判断。抑制率的计算方式为：抑制率(%)=〔1-(实验组吸光度-空白组吸光率)/(对照组的吸光率-空白组的吸光率)×100%〕〔4〕。吸光率使得测定设定的酶标仪的波长为490 nm。而后，固定环杷明的浓度为20%，将时间作为变量(1、2、3 d)，用上述方法，计算抑制率。

1.5Western印迹法测定 采用Western印迹法测定RBE产生的Glil蛋白及Smo蛋白的表达数量。

1.6统计学方法 应用SPSS18.0软件行χ2、t检验。

2 结 果

2.1环杷明对RBE的影响 经过环杷明处理过的RBE放置差相倒置显微镜下进行观察，镜下结果显示，REB的生长速度明显减缓，且细胞体积较不处理的细胞变小，形态更圆；其余的结构也发生变化，例如：细胞间的连接较正常细胞减少，少数甚至消失，大部分细胞由于脱水导致皱缩、细胞核固缩现象出现，这说明经环杷明的处理，对RBE产生了破坏〔5,6〕。此外，随时间的延长，这种现象也更为明显(见图1)。而经处理后的RBE，经过台盼蓝染色计数、经MTT法检测抑制率，结果显示，浓度为5、10、15、20、40 μmol/L的环杷明都可以通过调控Hedgehog信号通路而对REB的活性及增殖产生明显的抑制作用，且与空白对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。而控制环杷明的浓度，将时间作为变量的实验中，发现经环杷明处理时间越长，RBE的生长能力越弱(P<0.05)，见表1、表2。

图1 差相倒置显微镜下RBE的形态(×200)

项目空白对照组环杷明5 μmol/L10 μmol/L15 μmol/L20 μmol/L40 μmol/L细胞增殖率100801)621)581)441)301)细胞抑制率0311)521)491)511)611)

与空白对照组比较：1)P<0.05

表2 不同作用时间环杷明对RBE增殖和抑制的影响(%)

与0 h比较：1)P<0.05；表3同

2.2环杷明对RBE表达蛋白Glil和Smo的影响 不经过环杷明处理过的RBE表达的Glil及Smo的数量较高，而经过环杷明处理后的REB所翻译出两种蛋白质的量皆有所减少(P<0.05)；而且随着环杷明处理的时间越长，其表达数量越低(P<0.05)，见表3。

表3 环杷明处理不同时间对RBE表达蛋白Glil和Smo影响

3 讨 论

胆管癌的癌变细胞主要是肝内胆管的上皮细胞。当前，最主要、最有效的治疗方法为手术根治切除术。然而，由于其转移时间早、侵袭性强。所以传统的手术治疗后，其预后效果较差，而5年生存率也仍旧较低〔7,8〕。近年来，胆管癌的发病率持续增高，治疗此疾病的关键是早期诊断和治疗〔9〕。经查阅资料〔10〕发现，Hedgehog信号通路、TGF-β、Notch对肿瘤的发生具有促进作用。

在某些因素的作用下，如感染、重度、创伤，上皮细胞可以发生化生作用，由其原本的形态转变为纤维样细胞的形态〔11〕。这就使得细胞的极性丧失，并且细胞间的连接明显减弱，这就使得癌细胞的迁移及侵袭的能力增强。从而使细胞获得了间质细胞所具有的形态和特性，这种变化将其称之为EMT〔12〕。而EMT的主要特点就是上皮细胞极性的丧失和具有间质特殊性的获得。这一变化，是肿瘤早期转移的主要原因。在EMT的过程中，上皮细胞所表达的E-联环素、a-联环素、p-联环素水平下调〔13〕。肿瘤细胞发生EMT是癌细胞侵袭转移的必要条件。研究〔14〕发现，TGF-β1可以诱导RBE增殖。

Hedgehog信号通路在人类的早期器官的发育及发育成熟后的组织修护中有高度的保守性，这就对维护机体器官、组织甚至细胞的正常状态起到了重要的作用〔15〕。此信号通路只有在其受体与配体结合后才能被激活，激活后的Hedgehog信号通路可以解除对Smo的抑制作用，随后，Smo具有激活Glil的作用，激活的Glil可以被转运至细胞核，而后目的靶基因被激活发生转录，从而对染色的形成、细胞周期的活动，甚至对细胞的生长、运动、凋亡都起到调节作用〔16〕。有研究〔17〕证明，很多肿瘤的发生，如结肠癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌都与Hedgehog信号通路的激活关系密切。因此，特异性阻断剂环杷明可以通过阻断Hedgehog信号通路而抑制细胞反应。

环杷明的作用机制主要是在作用于Smo后抑制通路的活性。而它并不属于全身性的化疗药物，因此，用其治疗，对患者机体其他的组织器官并不会产生严重的副作用〔18〕。而Glil是位于Smo下游的一个因子，有着承上启下的调控作用。本研究与以往的相关研究〔19〕有着高度的一致性。本研究结果说明经环杷明的处理，对RBE细胞产生了破坏。此外，随时间的延长，这种现象也更为明显。本研究结果表明，环杷明可以很好地抑制RBE增殖，且这种关系有着剂量依赖性和时间依赖性。Hedgehog信号通路具有维持RBE增殖的作用，要想治疗胆管癌细胞可以考虑阻断这一信号通路。这与Thayer等〔20〕在胰腺癌得到的结论不谋而合。造成这一现象的机制可能是由于环杷明可以通过对抗Smo进一步控制Clil，Clil直接使血小板源性生长因子受体(PDGF)Rα及B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl)-2的表达降低，而凋亡细胞因子(Fas)和死亡受体(DR)5的表达升高。FAS及DR5都具有诱导细胞凋亡的活性，而Bcl-2可以经由多种途径进行调控，从而促进凋亡。以此推测，环杷明在抑制细胞增殖的过程可能与促进细胞凋亡的过程相互影响。

综上，环杷明作为特异性抑制剂可以通过阻断Hedgehog信号通路而对TGF-β1诱导的RBE细胞生物学行为学产生影响，主要可以抑制其增殖，其发生机制可能与抑制Glil及Smo蛋白的表达有关。

4 参考文献

1张 杨,徐 菁,张翠明,等.Hedgehog信号通路抑制剂对肝内胆管癌RBE细胞生物学行为的影响〔J〕.中国病理生理杂志,2016;32(3):5445-8.

2刘 妍，徐 菁，乔爱秀，等.长链非编码RNA母系表达基因3对肝内胆管癌RBE细胞耐药性的影响〔J〕.中国药物与临床，2017；17(5)：620-3.

3周向东,李 雪,马 彦,等.肿瘤转移抑制基因1及Gli1基因在子宫内膜腺癌细胞系中的表达〔J〕.中国生物制品学杂志,2016;29(7):701-3.

4陈祥和,李世昌,严伟良,等.Hedgehog信号通路对成骨细胞分化和骨形成的影响及不同方式运动的调控〔J〕.北京体育大学学报,2015;38(11):59-64.

5Hongbing GU,Xu LI,Zhou C,etal.Effects and mechanisms of blocking the hedgehog signaling pathway in human gastric cancer cells〔J〕.Oncol Lett,2015;9(5):1997.

6Liu Y,Du F,Zhao Q,etal.Acquisition of 5-fluorouracil resistance induces epithelial-mesenchymal transitions through the Hedgehog signaling pathway in HCT-8 colon cancer cells〔J〕.Oncol Lett,2015;9(6):2675-9.

7孙孝东,田洪伟,栗素文.外科治疗老年肝内胆管癌患者的远期生存状况及相关因素〔J〕.中国老年学杂志,2017;37(7):1688-90.

8Lu H,Chen B,Hong W,etal.Transforming growth factor-β1 stimulates hedgehog signaling to promote epithelial-mesenchymal transition after kidney injury〔J〕.FEBS J,2016;283(20):3771-90.

9He YH,Li Z,Ni MM,etal.Cryptolepine derivative-6h inhibits liver fibrosis in TGF-β1-induced HSC-T6 cells by targeting the Shh pathway〔J〕.Canad J Physiol Pharmacol,2016;94(9):987.

10方卫平,张筱凤.治疗性经内镜逆行性胰胆管造影术在老年胆胰疾病患者治疗中的应用价值〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(6):1392-3.

11张 杨,徐 菁,张翠明,等.Hedgehog信号通路抑制剂对肝内胆管癌RBE细胞生物学行为的影响〔J〕.中国病理生理杂志,2016;32(3):544-8.

12孟腾腾,魏 虹,管东方,等.Hedgehog信号通路抑制剂GANT61对急性髓系白血病细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.解剖学杂志,2017;40(4):403-7.

13赵一鸣,廖 泉,赵玉沛,等.Hedgehog信号通路与胰腺癌研究进展〔J〕.南昌大学学报(医学版),2016;10(2):240-3.

14邵欣宇,顾 燊,丁希伟,等.Hedgehog信号通路与胰腺癌吉西他滨固有耐药的相关性研究〔J〕.胃肠病学,2016;21(11):656-61.

15周明莉,唐石伏,张海龙,等.Hedgehog信号通路调控Twist高表达乳腺肿瘤干细胞样细胞的富集及迁移〔J〕.肿瘤,2017;37(10):1024-31.

16Yu SS,Chen B,Huang CK,etal.Ursolic acid suppresses TGF-β1-induced quiescent HSC activation and transformation by inhibiting NADPH oxidase expression and Hedgehog signaling〔J〕.Exp Therap Med,2017;14(4):3577.

17李若菲,白云飞,王芸姣,等.槲芪散可通过激活Hedgehog信号通路抑制大鼠肝癌前病变的形成〔J〕.中国病理生理杂志,2017;33(4):661-8.

18宋先兵,张俊强,曹 威,等.Hedgehog信号通路阻断剂环巴胺体外对佐剂性关节炎大鼠的关节软骨细胞增殖的影响〔J〕.解剖学报,2016;47(6):763-8.

19Ingham PW,McMahon AP.Hedgehog signaling in animal development:paradigms and principles〔J〕.Genes Dev,2001;15(23):3059-87.

20Thayer SP,di Magliano MP,Heiser PW,etal.Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis〔J〕.Nature,2003;425(6960):851-6.