硒干预对DEHP暴露下SD大鼠血细胞参数的作用

杨梅，曹乾， *，宁俊康，任雪丹，王民生

（1．东南大学公共卫生学院，江苏南京210009；2．江苏省疾病预防控制中心，江苏南京210009）

硒(selenium，Se)是一种人体必需微量元素，是过氧化物系统内谷胱甘肽过氧化物酶发挥酶活性所需的必要元素[1]。相关动物实验证明，Se可以保护肝细胞免受细胞毒性损伤，具有抗氧化作用，提高实验动物的免疫能力[2-6]。

邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)是邻苯二甲酸酯类(phthalates acid esters，PAEs)化合物的重要成员[7-8]。由于其实用性和成本效益，DEHP常被工业上用作增塑剂和改性剂于塑料(聚氯乙烯)生产中，还是一些驱虫剂、化妆品、食品包装袋、医疗用品和玩具的生产原料，被认为是广泛的环境持久性有机污染物[2，9-11]。DEHP可以通过呼吸道、消化道、皮肤接触或医疗过程进入机体，对人体具有潜在损害。有研究证明，其毒性作用主要表现为生殖毒性、免疫毒性、遗传毒性、神经毒性、肝肾毒性等[11-12]。

本研究通过对SD大鼠进行不同剂量DEHP染毒，同时在不同剂量染毒下 给 予1mg/kg硒干预保护，测定各组SD大鼠血细胞参数，以研究硒干预对DEHP暴露SD大鼠血细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

酵母硒(有机硒含量≥99% ，江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供)；DEHP(纯度≥99.5%，美国Sigma公司)。ADVIA2120i型全自动五分类血细胞分析仪(德国Siemens公司)。

1.2 动物分组与染毒

选择健康清洁级雄性SPF级SD大鼠77只，体质量70~90g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001，质量合格证编号11400700158173；饲养于屏障动物实验室，实验动物环境使用许可证号SYXK(苏)2017-0031。动物实验室温度控制在20~26℃，湿度为40%~70%，单笼饲养。适应性饲养3d后，将受试SD大鼠按体质量随机分为7组，即对照组、3个DEHP染毒组(分别为300、600和900mg/kg)、3个Se干预组(在3个DEHP染毒组饲料中分别添加1mg/kg酵母硒)，每组11只。DEHP和酵母硒均按相应比例均匀拌入基础饲料中，制成颗粒饲料，将饲料以平均每日动物体质量10%的摄食量按组别给予大鼠，连续饲喂染毒90d。染毒期间，大鼠可自由饮水、摄食。

1.3 染毒前后体质量和一般情况观察

试验期间观察并记录大鼠的一般情况，如日常行为表现、中毒体征(精神亢奋、被毛蓬松、局部脱毛现象)和死亡情况等；染毒干预90d时，大鼠空腹16h后称取最终体质量，采股静脉血。

1.4 血细胞参数的检测

对SD大鼠采血，用滴加EDTA抗凝剂的1.5mL EP管取SD大鼠全血1.0mL，全自动血细胞分析仪进行血细胞参数分析。检测红细胞数(red blood cell，RBC)、血红蛋白含量(hemoglobin，HGB)、红细胞压积(hematocrit，HCT)、平均红细胞体积(mean corpuscular volume，MCV)、平均血红蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、平均细胞血红蛋白浓度(mean cellular hemoglobin concentration，MCHC)、红细胞体积分布宽度(red blood cell distribution width，RDW)、血红蛋白含量分布宽度(hemoglobin content distribution width，HDW)；白细胞数(white blood cell，WBC)、中性粒细胞比例(neutrophil ratio，NEUT)、淋巴细胞比例(lymphocyteratio， LYM)、 单 核 细 胞 (monocytes，MONO)、嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)、嗜碱性粒细胞 (basophilic granulocyte， BASO)； 血 小 板 总 数(platelet，PLT)、平均血小板体积(mean platelet volume，MPV)、血小板分布宽度(platelet distribution width，PDW)、血小板压积(plateletcrit，PCT)等指标。

1.5 统计学方法

采用SPSS18.0进行统计学分析，多组间均数比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析，各实验组与对照组用Dunnett’s法比较，所有结果用±s表示，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 硒干预对不同剂量DEHP染毒SD大鼠体质量和体征的影响

与对照组比较，600和900mg/kg DEHP染毒组SD大鼠体质量显著下降(P<0.05或 P<0.01)，且随着剂量的增加，体质量差异越明显。此 2组动物均表现出精神亢奋、被毛蓬松、局部脱毛(头颈部、四肢及腹部)等中毒体征。将实验过程中出现上述阳性症状的大鼠视为中毒，结果显示不同剂量DEHP染毒SD大鼠中毒体征差异具有统计学意义(P<0.05)。试验期间无大鼠死亡。与相同DEHP剂量染毒组相比，1mg/kg Se+各剂量DEHP干预组大鼠体质量均明显增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)，且1mg/kg Se+300和600mg/kg DEHP干预组大鼠体质量与对照组相当(P均>0.05)。与相同剂量DEHP染毒组比较，1mg/kg Se+300和600 mg/kg DEHP干预组大鼠中毒体征差异有统计学意义(P均<0.05)。提示硒干预改善了300和600mg/kg DEHP染毒组大鼠的中毒症状。见表1。

表 1 硒干预对不同剂量DEHP 染 毒 S D大鼠体质量和中毒体征的影响(±s， n =11)

表 1 硒干预对不同剂量DEHP 染 毒 S D大鼠体质量和中毒体征的影响(±s， n =11)

与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与相同剂量DEHP染毒组相比，#P < 0.05，## P<0.01.

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2.2 硒干预对不同剂量DEHP染毒SD大鼠白细胞参数的影响

见表2。结果显示，600和900mg/kg DEHP染毒情况下，大鼠白细胞总数显著下降，单核细胞比例显著升高，与对照组相比差异均具有统计学意义(P均<0.05)。1mg/kg Se+600mg/kg DEHP干预组与600mg/kg DEHP染毒组相比较，白细胞总数增加而单核细胞比例下降，差异均具有统计学意义(P均<0.05)，而与对照组相比差异均无统计学意义(P均>0.05)。

表2 硒干预对不同剂量DEHP 染 毒 S D 大 鼠白细胞参数的影响(±s， n =11)

表2 硒干预对不同剂量DEHP 染 毒 S D 大 鼠白细胞参数的影响(±s， n =11)

与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与相同剂量DEHP组相比，# P <0.05，## P<0.01.

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2.3 硒干预对不同剂量DEHP染毒SD大鼠红细胞参数的影响

见表3。结果显示，300、600、900mg/kg DEHP染毒大鼠平均血红蛋白量、血红蛋白含量分布宽度水平均显著升高，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。600和900 mg/kg D EHP染毒组大鼠红细胞总数和红细胞压积水平显著下降，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。1mg/kg Se+300mg/kg DEHP干预组大鼠红细胞压积与对照组和DEHP染毒 组 相比，差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.4 硒干预对不同剂量DEHP染毒SD大鼠血小板的影响

见表4。在DEHP染毒与Se干预期间，未发现大鼠各组血小板参数出现明显差异。

3 讨论

大鼠经不同剂量DEHP染毒后造成了不同程度体质量的下降和中毒体征，体质量的下降和中毒大鼠的比例具有剂量依赖性，DEHP剂量越高，体质量下降越明显，中毒大鼠的比例越高。进行硒干预后，300和600mg/kg剂量组大鼠体质量和中毒体征比同剂量单独DEHP染毒组有明显改善，与对照组间差异无统计学意义，可见硒干预对低中剂量DEHP染毒大鼠具有积极的保护作用[1，6]。

白细胞是机体内的免疫细胞，具有防御和免疫的能力，参与对细菌、病毒等异物入侵时的免疫过程，白细胞各项指标的变化是机体免疫力变化的标志[13-14]。不同剂量DEHP染毒对大鼠NEUT、LYM、LUC、EOS、BASO指标未见显著影响，在600和900 mg/kg DEHP染毒情况下，大鼠WBC显著下降，MONO显著升高，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，说明中高剂量DEHP暴露可能影响大鼠机体的免疫功能，破坏白细胞产生细胞毒性[15]。进行硒干预后，Se+600mg/kg DEHP干预组大鼠WBC和MONO水平与对照组相比差异无统计学意义，而Se+900mg/kg DEHP干预组大鼠的WBC和MONO水平与对照组相比仍然存在显著差异，可见 1mg/kg Se在高剂量染毒下干预并不能对白细胞起到保护作用，这可能是在高浓度DEHP暴露下，机体自由基产生增加，影响机体的抗氧化酶系及氧化损伤，该结果与相关研究报道结果一致[11，13]。傅晗等[14]2015年研究硒在大鼠肝脏氧化损伤中作用研究中表明，Se元素作为人体必需的微量元素具有抗氧化作用，一定剂量情况下能够保护细胞免受染毒暴露侵害，与本研究硒的作用结果一致。本研究结果显示一旦DEHP剂量过高，造成的氧化损伤过强，此时Se干预并不能再对白细胞起到保护作用[1]。

表3 硒的干预对不同剂量DEHP 染 毒SD 大 鼠红细胞相关指标的影响(±s，n=11)

表3 硒的干预对不同剂量DEHP 染 毒SD 大 鼠红细胞相关指标的影响(±s，n=11)

度；RDW：红细胞体积分布宽度；HDW：血红蛋白含量分布宽度.与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与相同剂量DEHP组相比， #P <0.05，##P<0.01.

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表4 硒的干预对不同剂量DEHP 染 毒 S D大鼠血小板相关指标的影响(x±s，n=11)

红细胞是血红铁蛋白的重要载体，负责供给机体组织和细胞所需的氧气，对机体的正常运行具有重要作用[12]。大鼠DEHP不同剂量染毒后红细胞参数检测结果显示HGB、MCV、MCHC、HDW与对照组相比差异不显著，各剂量DEHP染毒SD大鼠MCH、HDW水平显著升高(P<0.05)。600和900mg/kg DEHP染毒剂量组SD大鼠RBC和HCT水平显著下降(P<0.05)。RBC和HCT主要用来判断有无贫血及贫血的程度，结果表明中高剂量DEHP染毒情况下机体产生贫血状态，携带所需的氧气能力也显著下降[15-16]。进行硒干预后结果与DEHP染毒组未见显著差异，说明硒在红细胞受损伤的情况下并不能起到积极的保护作用[1，7，14，17]。赵春风等[12]2014年对血细胞氧化应激研究中亦证明DEHP染毒对红细胞造成损伤。血小板的功能主要是促进止血和加速凝血，以及维护毛细血管壁完整性，在本实验中，不同剂量的DEHP染毒组大鼠血小板相关指标未见显著差异。说明DEHP对大鼠的凝血止血功能无显著影响。

综上所述，300~900mg/kg DEHP染毒会对大鼠体质量、中毒体征以及相关血细胞参数产生一定的影响，硒干预在300~600mg/kg DEHP染毒条件下对大鼠体质量、中毒体征、血细胞参数产生积极的保护作用。

[1]孙玲，屈艾，李宗芸，等.氯化镨对小鼠骨髓细胞DNA的损伤及硒的干预作用[J].毒理学杂志，2017，31(4)：296-300.

[2]YANG SY，ZHANG L，MIAO K K，et al.Effects of selenium intervention on chronic fluorosis-induced renal cell apoptosis in rats[J].Biol Trace Elem Res，2013，153(1/2/3)：237-242.

[3]WANG B，LIU F，DONGJ，et al.Maternal exposure to environmental DEHP exacerbated OVA-induced asthmatic responses in rat offspring[J].Sci Total Environ，2018，615(1)：253-261.

[4]李晓丽，何万领，文凤云，等.酵母硒对蛋鸡血清酶活性及抗氧化能力的影响[J].中国兽医学报，2017，37(2)：318-321.

[5]周庆彪，刘颖，孔德钦，等.硒对慢性镉暴露致大鼠肾损伤的保护作用与机制[J]. 癌 变·畸变·突变，2018，30(1)：1-7.

[6]王佳，董四君.邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)毒理与健康效应研究进展[J].生态毒理学报，2012，7(1)：25-34.

[7]李丽萍，黄凌燕，张亚娟，等.DEHP低剂量慢性暴露对雌性大鼠糖代谢的影响[J].环境与职业医学，2017，34(8)：669-675.

[8]徐缙.DEHP对青春期大鼠糖代谢的影响及其机制[D].长春：吉林大学，2017.

[9]李诺，任雪丹，吕中明，等.DEHP亚慢性暴露对大鼠精子运动参数影响[J].中国公共卫生，2017，33(4)：611-613.

[10]唐啸.DEHP通过氧化应激和Fasl途径诱导GC-2spd细胞凋亡[D].武汉：武汉科技大学，2016.

[11]章子贵，许晓路，申秀英.不同硒水平对大鼠免疫力和血细胞的影响[J].微量元素与健康研究，2005，2(2)：1-2.

[12]赵春风，刁晓平，谢嘉，等.邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)对马氏珠母贝(Pinctada martensi)血细胞免疫功能及氧化应激效应的影响[J].生态毒理学报，2014，9(2)：375-381.

[13]董晋，董新文，赵跃，等.长期暴露的邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯在雌性大鼠体内的代谢及对肝脏的影响[J].癌变·畸变· 突变，2017，29(3)：211-215.

[14]傅晗，刘颖，刘江正，等.硒对镉暴露大鼠肝脏氧化损伤的保护作用及机制研究[J].癌变· 畸变· 突变，2015，27(2)：95-100.

[15]逯晓波，于涛，马明月，等.邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对大鼠睾丸发育及StAR、CYP19a1、CYP11a1基因表达的影响[J].卫生研究，2010，39(3)：263-267.

[16]郭咏梅，张博綦，闫素梅，等.硒对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用[J].动物营养学报，2017，29(9)：3375-3384.