CD11c+细胞特异性敲除TAK1对刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤的影响

周文娟，雷志明，魏雪涛，郝卫东*

（北京大学公共卫生学院毒理学系/食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京100191）

刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)可以通过尾静脉注射，特异性作用于小鼠肝脏，造成肝脏损伤[1]。关于该损伤机制的研究显示，Con A并不直接作用于小鼠肝细胞[2]，但可以引起肝脏内免疫细胞和相关细胞因子的聚集，进而诱导免疫介导的肝脏损伤[3]。Con A诱导的肝损伤常被用于模拟自身免疫性肝炎和乙型病毒性肝炎等，具有时间短和损伤具有剂量反应关系等特点[1，4-6]。

研究表明，枯否细胞(Kupffer cell，KC)是Con A诱导免疫性肝损伤中的关键性非实质细胞，树突状细胞(dendritic cell，DC)也在该损伤中起到一定的作用。CD11c是KCs和DCs的表面分子[7]，与KCs和DCs有关且参与Con A诱导的免疫性肝损伤的细胞因子有肿瘤坏死因子 α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、 γ 干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素(IL-4/5/6 /12)等。这些因子中最关键的为TNF-α和IFN-γ。

转化生长因子 β激活激酶1(TGFβ-activated kinase 1，TAK1)，是一种体内常见的蛋白激酶，参与细胞的增殖与分化，在炎症的发生和发展过程中起着重要作用[8-9]。目前已有部分研究探讨了TAK1与肝损伤之间的关系[10-11]。Song等[12]研究表明肝实质细胞敲除TAK1可以诱导自发性肝炎、肝纤维化和肝癌。然而仅有少量研究探讨了肝中非实质细胞TAK1在该损伤中的作用，尚未见有关CD11c+细胞中TAK1敲除对于该损伤的研究。因此，本文利用在CD11c+细胞中特异性敲除TAK1基因的动物模型，研究免疫细胞中TAK1在Con A诱导的早期免疫性肝损伤中所起的作用，旨为临床肝炎治疗新靶点的探索提供理论线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

FloxedMap3k7(Map3k7fl/fl) 和CD11c-Cre小鼠购自美国Jackson实验室，该小鼠为C57BL/6背景。将Map3k7fl/fl和CD11c-Cre小鼠进行交配，产生Map3k7fl/flCD11c-Cre小鼠，该小鼠体内CD11c+细胞中特异性缺失Map3k7(TA K1)基因。对照C57BL/6小鼠为带有CD11c-Cre的小鼠，以排除Cre的影响[13]。

所有小鼠均选取雌性，8~12周龄，SPF级，体质量18~22g，饲养于屏障环境中，温度20~25℃，相对湿度40%~70%，12h/12h明暗交替循环，饲料为符合国家标准的无菌饲料，饮用水经过滤除菌处理。动物实验符合北京大学动物伦理委员会相关规定。

将CD11c+细胞特异性敲除TAK1的C57BL/6小鼠，经鼠尾静脉注射Con A(12mg/kg)或生理盐水，分别作为Con A敲除组和生理盐水敲除组。另选C57BL/6小鼠，鼠尾静脉注射Con A(12mg/kg)或生理盐水，作为Con A对照组和生理盐水对照组，共4组，每组7只。注射6h之后取血，断髓处死动物，进行相关指标检测。

1.2 试剂与仪器

Ⅳ型刀豆蛋白A(Con A)购自美国Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶(alamine aminoteansferase，ALT)、天门冬氨酸转移酶(aspartate aminotransferase，AST)以及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)检测试剂盒购自四川麦克生物科技股份有限公司；小鼠TNF-α、小鼠IFN-γ酶联免疫吸附法(ELISA) 试剂盒和多因子小鼠Th1/Th2检测试剂盒(6因子)购自eBioscience公司。

HITACHI-7170A全自动生化分析仪为日本日立公司产品；ThermoMK3型酶标仪为中国赛默飞世尔科技有限公司产品；正置荧光显微镜(Nikon E400)，realtime PCR扩增仪为Bio-Rad产品。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 小鼠血清ALT、AST、LDH测定小鼠眼部取血，4℃静置1h后，2500r/min离心10min，取上清，全自动生化分析仪检测ALT、AST和LDH活性。

1.3.2 小鼠脏器系数计算动物麻醉后处死，摘取肝、脾、肺、肾和胸腺，称取质量并计算脏器系数。

1.3.3 小鼠肝脏病理学观察及评分制备肝脏病理切片，进行HE染色，光学显微镜观察，定性描述相关的病理学特征。根据肝脏病变程度按照如下标准分为4级：0级，正常肝组织，记0分；1级，轻度炎性细胞浸润，偶伴有单个肝细胞坏死，记1分；2级，中度肝细胞损害伴炎症细胞浸润和局灶性肝细胞坏死，记2分；3级，汇管区和肝小叶内广泛炎症细胞浸润，伴广泛的肝细胞坏死[14]。

1.3.4 小鼠血清中白细胞介素、TNF-α和IFN-γ表达测定收集小鼠血清，酶标仪测定450和570nm处白细胞介素IL-4/5/6/12、TNF-α和IFN-γ的吸光度值，计算细胞因子含量。

1.3.5 小鼠肝中TNF-α和IFN-γ表达测定取少量肝组织进行匀浆，12000r/min离心20min，取上清，酶标仪测定450nm和570nm处TNF-α和IFN-γ的吸光度值，计算细胞因子含量。

1.4 统计分析

应用SPSS19.0进行数据分析，多组均数间比较采用单因素方差分析，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验，两组均数之间比较采用t检 验，方差不齐时采用t检验； α=0.05为检验水准。在对免疫相关细胞因子分析时，剔除数值超过两倍标准差的异常数据。

2 结果

2.1 CD11c+细胞中特异性敲除TAK1对血清生化指标的影响

与生理盐水对照组相比，生理盐水敲除组小鼠血清中ALT、AST和LDH水平无显著改变，Con A对照组中血清ALT和LDH水平显著升高(P均<0.05)。与Con A对照组相比，Con A敲除组小鼠血清ALT、AST和LDH水平均显著升高(P均<0.05)。见表1。

表1 CD11c+细胞中特异性敲除TAK1对小鼠血清生化指标的影响(-x±s，n=7)

2.2 CD11c+细胞中特异性敲除TAK1对脏器系数的影响

与生理盐水对照组相比，生理盐水敲除组小鼠仅肝脏系数显著升高(P<0.05)，Con A对照组肝脏和脾脏脏器系数显著升高(P均<0.05)。与Con A对照组相比，Con A 敲除组 小 鼠的肝脏、肺脏和肾脏脏器系数均显著升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)，脾脏和胸腺脏器系数无明显改变。见表2。

表2 CD11c+细胞特异性敲除 TAK1对脏器系数的影响(-x±s，n=7)

2.3 CD11c+细胞中TAK1特异性敲除对Con A引起的肝组织病理损伤的影响

与生理盐水对照组(0分)相比，生理盐水敲除组小鼠肝脏病理评分(0.43±0.53)无明显改变，Con A对照组病理评分(2.14±0.69)则显著升高(P<0.05)。与Con A对照组相比，Con A敲除组病理评分(2.86±0.38)显著升高(P<0.05)。Con A对照组损伤主要表现为点灶状坏死或汇管区炎症，其中前者表现更为显著而普遍，汇管区周围存在轻度坏死，肝小叶内肝细胞的坏死以点灶状为主，无明显的片状或桥接坏死；Con A敲除组损伤类型由早期坏死转变为明显的灶状坏死或汇管区炎症，有明显的片状坏死和桥接坏死，同时存在多个出血坏死灶。所有肝脏均未见明显纤维化表现。见图1。

2.4 CD11c+细胞中TAK1特异性敲除对Con A诱导的血清免疫因子表达的影响

与生理盐水对照组相比，生理盐水敲除组 小 鼠血清各细胞因子水平均未见明显改变，Con A对照组血清TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-6水平均显著升高(P均<0.05)，血清IL-12水平无明显改变。与Con A对照组相比，Con A敲除组血清TNF-α、IL-4和IL-6水平均显著升高(P均<0.05)，而血清IFN-γ、IL-5和IL-12水平无明显改变。见图2。

2.5 CD11c+细胞中TAK1特异性敲除对Con A诱导的肝组织中TNF-α和IFN-γ表达的影响

见图 3。与生理盐水对照组比较，生理盐水敲除组 小 鼠肝组织中TNF-α的含量明显下降(P<0.05)，IFN-γ水平无明显改变；Con A对照组肝组织中两因子均显著升高，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。与Con A对照组相比，Con A敲除组小鼠肝组织中IFN-γ水平显著升高， 差异具有统计学意义(P<0.05)，TNF-α水平无明显改变。

图1 CD11c+ 细 胞特异性敲除TAK1 对C on A 引 起的肝脏病理组织学的影响(H E， ×200)

图2 CD11c+ 细 胞中TAK1 特 异性敲除对 C on A 诱 导的血清细胞免疫因子表达的影响(n=5)

图3 CD11c+ 细 胞中TAK1 特 异性敲除对C on A 诱 导的肝细胞因子的影响(n=5)

3 讨论

Con A是一种从刀豆中提取出来的蛋白。1992年Tiegs等[4]首次发现尾静脉注射Con A可以特异性引起小鼠的免疫性肝损伤。Con A入血之后主要聚集在肝中，并作用于肝窦内皮细胞，使细胞破损。之后该蛋白会穿过肝窦内皮与Kupffer细胞结合，激活肝中的免疫反应，聚集的免疫细胞和因子会进一步作用于肝细胞，造成肝细胞的变性和坏死[3]。Con A诱导免疫性肝损伤主要表现为血生化指标升高和肝脏病理损伤加重[15]。本课题组前期研究显示，当Con A鼠尾静脉注射剂量为12mg/kg时，实验小鼠的肝脏存在轻度损伤，肝和血清中TNF-α和IFN-γ的水平均升高。故本实验Con A注射剂量均为12mg/kg，以便于探索CD11c+细胞中TAK1蛋白对于Con A诱导的免疫性肝损伤的作用。

本研究结果显示，与生理盐水对照组相比，Con A敲除组和Con A对照组反映肝损伤严重程度的血生化指标显著升高(P均<0.05)，而生理盐水敲除组的血生化无明显改变。Con A敲除组的血生化指标明显高于Con A对照组(P均<0.05)。肝脏病理及病理评分变化与血生化一致。提示单独敲除CD11c+细胞中的TAK1并不会引起肝细胞明显的损伤和死亡，造成肝脏的明显损伤。这也说明CD11c+细胞中的TAK1蛋白可能并不直接参与维持肝细胞的存活。但是CD11c+细胞中TAK1 的敲除对于Con A诱导的免疫性肝损伤起协同作用，TAK1敲除可使肝脏对于外来刺激更加敏感。CD11c+细胞中的TAK1蛋白参与了Con A诱导的免疫性肝损伤。Wang等[16]曾证明在CD11c+细胞特异性敲除TAK1的小鼠中TAK1缺失导致CD11c+细胞凋亡显著上升，从而致淋巴和非淋巴组织中的DCs群体枯竭。DCs 的缺失可以进一步导致肝中免疫稳态失衡。Tomiyama 等[17]发现Con A给药小鼠的肝树突状细胞过继性转移有抑制Con A诱导肝损伤的作用。提示CD11c+细胞中特异性敲除TAK1很有可能是通过DCs凋亡，造成肝中免疫稳态失衡，进而加重Con A诱导的肝损伤。然而近期也有报道称CD11c-白喉毒素受体转基因小鼠或用抗CD11c抗体导致小鼠CD11c+D C枯竭，可减轻Con A诱发的肝损伤[18]。该结果与本研究结果不一致，其可能原因为文献中起关键作用的DCs为常规树突状细胞(cDC)，而小鼠肝中的DC为浆细胞样树突状细胞(pDC)[19]，虽然均为树突状细胞，两者在免疫反应中所起作用不同。浆细胞样树突状细胞参与维持免疫耐受[20]。

KCs和DCs可以通过分泌一系列细胞因子，进一步诱导免疫反应。本研究结果显示，与生理盐水对照组相比，生理盐水敲除组的肝TNF-α水平降低(P<0.05)，而其他细胞因子均无明显改变。Con A对照组中血清和肝匀浆中细胞因子除IL-12外水平均升高(P均<0.05)。与Con A对照组相比，Con A敲除组的肝IFN-γ，血清TNF-α、IL-4和IL-6水平均显著升高(P均<0.05)，肝TNF-α和血清IFN-γ、IL-5和IL-12水平未见明显改变。表明CD11c+细胞的TAK1蛋白与免疫性肝损伤有关，该细胞中TAK1敲除可影响Con A诱导的免疫性肝损伤中细胞因子的分泌，加重肝脏炎症。但CD11c+细胞中TAK1的敲除不会影响血清IL-5 和IL-12的分泌。

TNF-α和IFN-γ是Con A诱导免疫性肝损伤中的关键因子，而肝组织中IFN-γ主要由聚集到肝内的T细胞分泌，TNF-α则主要由KCs分泌。肝外这两个因子则主要由T细胞分泌。本研究结果显示，与生理盐水组相比，Con A对照组血清和肝 组 织TNF-α和IFN-γ水平均显著升高(P均<0.05)，生理盐水对照组血清和肝组织中IFN-γ，血清TNF-α水平均未见明显改变，肝组织TNF-α水平显著下降(P<0.05)。与Con A对照组相比，Con A敲除组肝 组 织中IFN-γ和血清中TNF-α均显著升高(P均<0.05)，而肝 组 织TNF-α和血清IFN-γ水平无明显改变，提示CD11c+细胞中TAK1的敲除影响了这两种因子的分泌。肝 组 织中IFN-γ表达增加，血清中则无明显改变，说明TAK1的敲除可促进已经聚集在肝中的T细胞分泌IFN-γ，而对肝外的T细胞分泌IFN-γ则无直接影响。和Con A对照组相比，Con A敲除组中TNF-α在血清中显著升高，但在肝匀浆中却无明显改变，而与生理盐水对照组相比，肝中TNF-α分泌明显降低，提示CD11c+细胞中TAK1的敲除可能抑制了肝中KCs分泌TNF-α。这些均提示CD11+细胞中的TAK1敲除可以抑制KCs分泌TNF-α，促进肝中聚集的T细胞分泌IFN-γ，进一步加重炎症反应。

Th1型细胞主要分泌TNF-α、IFN-γ和IL-2等细胞因子，Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等细胞因子。IL-4主要由T细胞分泌，可以刺激单核、肥大细胞等增殖，增强抗原呈递功能，刺激NK细胞等分泌IFN-γ。本研究中，和Con A对照组相比，Con A敲除组血清中该因子表达显著升高，说明TAK1的敲除可以刺激T细胞分泌IL-4，加重炎症反应。IL-6是一种主要由Th2型细胞、巨噬细胞、甲状腺细胞和成纤维细胞产生的炎症因子，具有抗感染，促进B细胞分泌抗体等多种生物活性作用[20]。本研究发现，CD11c+细胞TAK1的敲除可以明显促使血清中IL-6分泌增加。IL-5也在急性炎症反应中发挥了重要的作用，有研究表明，IL-5的敲除可以明显加重血液、脾和骨髓中嗜酸性粒细胞的浸润，延长该细胞的寿命[21]。而本研究中可以看到鼠尾静脉注射Con A的小鼠其IL-5分泌明显增加，但Con A敲除组和Con A对照组间无明显差异，说明Con A可以促进肝中嗜酸性粒细胞的浸润，但CD11c+细胞中TAK1的敲除不会影响IL-5的分泌，即不会影响机体嗜酸性粒细胞的增殖和分化。

IL-12主要由单核巨噬细胞和树突状细胞等抗原提呈细胞以及B细胞分泌。中性粒细胞和Th细胞也可分泌该因子。而该因子可以有效刺激NKT细胞和NK细胞的活性，促进Th1细胞的发育，诱导多种细胞因子产生，从而加重炎症[22]。而本研究结果显示，经鼠尾静脉注射Con A之后，Con A对照组和Con A敲除组之间无明显差异，说明CD11c+细胞TAK1的敲除不会影响IL-12分泌。而其具体机制尚需进一步探讨。

综上所述，CD11c+细胞中TAK1的敲除可以促进Con A诱导的肝损伤中肝细胞的坏死，加重肝组织损伤，抑制KCs中TNF-α的分泌，但不影响DCs等细胞分泌的IL-12，不影响嗜酸性粒细胞的增殖和分化。同时CD11c+细胞中TAK1的敲除可以促进该损伤中部分Th1和Th2型细胞因子的分泌，提示CD11c+细胞中TAK1的功能可能为维持肝中的免疫稳态。当CD11c+细胞中TAK1被敲除时，可加重Con A诱导的免疫性肝损伤。

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