针刺“足三里”对免疫抑制大鼠的作用及穴区CGRP表达影响的研究*

代巧妹，王美峤，颜培宇，2△，尚艳琦，梁 慧，蔡文辉，王 垚

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.澳门科技大学，中国 澳门 519020)

足三里为胃经合穴，有补益脾胃、调和气血、祛邪防病之功。对针刺腧穴的作用机理研究证明：腧穴作用中的“调和气血”即包括了现代解剖学中的淋巴系统[1-4]。有报道针刺可以调整人体白细胞总数，使之趋向正常；家兔动物实验亦证实针灸足三里穴对白细胞总数有一定影响，且中性粒细胞的变化与白细胞总数的变化呈平行关系。另有研究显示针刺足三里治疗疟疾可以使淋巴细胞的转化率提高[5]。这些研究表明足三里穴可能对免疫系统产生一定作用，但缺乏相关动物实验研究的进一步证实。皮肤重要神经递质的降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)与表皮和真皮内的多种靶细胞接触，可直接影响皮肤内重要的具有抗原提呈功能的树枝状细胞-郎格汉斯细胞以及微血管内皮细胞的功能。针刺调节神经末梢CGRP的释放，与针刺的神经保护、抗缺血、调节血压、调节胃肠运动、保护胃黏膜、免疫调节、镇痛作用等均有密切联系，这些研究结果提示CGRP可能参与针刺效应，而这种效应在不同的疾病中会引起不同靶器官效应[6-8]。在本研究中，笔者用免疫抑制剂环磷酰胺建立免疫抑制大鼠模型，使用传统针刺和电针两种方法针刺大鼠足三里穴，并研究局部穴区CGRP变化，从而揭示针刺治疗疾病的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

健康SD雄性大鼠30只，体质量280～350 g。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(京)2007-0001。

1.2 药品和试剂

Super M-MLV反转录酶(北京百泰克生物技术有限公司)，RNA simple Total RNA Kit(天根生化科技北京有限公司)，环磷酰胺(上海谷研实业有限公司)，2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物技术有限公司)，RNase固相清除剂(北京天恩泽基因科技有限公司)，引物(生工生物工程上海有限公司)。

1.3 仪器

电针仪(汕头市医用设备厂)，凝胶成像分析仪(北京六一生物科技有限公司)，水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，PCR仪(杭州博日科技有限公司)，ADVIA 120血球分析仪(德国西门子公司)。

2 实验方法

2.1 实验分组及造模

正常SD雄性大鼠30只，随机分为正常组、假手术组、模型组、针刺组和电针组共5组，每组各6只。正常组小鼠不做任何处理，假手术组腹腔注射0.9%无菌生理盐水3天，第4天加强注射1次。其余各组均腹腔注射新鲜配制的环磷酰胺注射液(50 mg/kg)，连用3天，第4天加强注射1次，制备免疫抑制模型[9]。

2.2 针刺选穴及针刺操作方法

根据华兴邦《大鼠穴位针灸图谱》，取 “足三里”穴。针具选择30号针，进针3 mm。针刺手法：补法(重插轻提、徐徐捻转、吸气时进针)[8]。针刺组施行补法治疗，留针30 min，每日1次。电针组给予电针补法治疗，连续波，频率20 Hz，强度1～2 mA，持续30 min，每日1次。实验各组大鼠绑缚固定操作，正常组、假手术组及模型组分别绑缚但不针刺，治疗7天。

2.3 测定白细胞计数

大鼠尾静脉取血，用乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂，用ADVIA-120 血球分析仪检测白细胞计数。

2.4 测定脾脏、胸腺指数

各组大鼠称重，无菌取大鼠脾与胸腺，称重，根据文献计算脾脏与胸腺指数[9]。

2.5 总RNA提取及cDNA的制备

治疗结束后，处死大鼠，取“足三里”区大约皮下10 mm×3 mm区域组织，迅速冷冻于液氮瓶。研砵预冷，加入液氮充分研磨组织，待组织呈粉末状加入1 mL RZ裂解液，充分混匀，在室温下放置5 min。利用总RNA提取试剂盒提取样本总RNA。比色杯测RNA浓度，用1 μg的RNA去逆转录，每12 μL体系中加入oligo (dT)151 μL，random 1 μL，dNTP(2.5 mMeach) 2 μL，5×Buffer 4 μL，RNasin 0.5 μL，M-MLV 1 μL，实验样品RNA 2 μL。逆转录反应条件：25℃温浴10 min， 42℃温浴50 min，95 ℃ 加热5 min终止反应，将逆转录后的cDNA产物置于-20℃保存。

2.6 PCR反应

PCR反应体系， 2×Taq PCR Master-mix 10 μL，CDNA 1 μL，上游特异性引物1 μL，下游特异性引物1 μL，ddH2O补足至20 μL。β-actin引物序列：上游引物：5′GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TAG C3′，下游引物：5′GGC CGG ACT CAT CGT ACT CCT GCT T3′，β-actin扩增条件：95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 20 s变性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 延伸，4 ℃ 5 min终末延伸。30循环，4℃保温。CGRP引物序列：上游引物：5′CAG GAG GAG GAA CAG GAG GCT3′，下游引物：5′CAG GTG CTC CAA CCC CAA T3′[8]，CGRP扩增条件：95 ℃ 5 min预变性，95 ℃ 20 s变性，62 ℃ 20 s退火，72 ℃延伸，4 ℃ 5 min终末延伸。30循环，4℃保温。

2.7 统计方法

3 结果

3.1 各组免疫抑制相关指标评价

针刺组大鼠体重、脾脏、胸腺指数及白细胞计数与模型组相比显著增加，电针组大鼠体重、胸腺指数与模型组相比显著增加，见表1。

3.2 各组穴区内CGRP表达比较

RT-PCR结果显示：电针组和针刺组治疗后，穴区CGRPmRNA表达量显著下降，与模型组比较有显著性差异；针刺组下降程度显著高于电针组，两组比较有显著性差异。见图1、表2。

图1 针刺对“足三里”穴区CGRPmRNA表达的影响注：M：Marker;MJ：模型组；AJ：电针组；BJ：针刺组

组别体重(g)WBC(×103/ul)脾脏指数胸腺指数正常组300.41±62.5911.27±3.882.37±0. 762.15±0. 64假手术组287.19±59.2810.93±3.562.25±0. 581.93±0. 74模型组234.21±66.574.92±1.991.46±0. 621.18±0. 49电针组254.59±70.62*6.55±2.351.61±0. 601.57±0. 60*针刺组266.43±72.73*9.23±3.18**1.98±0. 73**1.8±0.005 6**

注:与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05

表2 各组大鼠“足三里”穴区内CGRP表达情况比较

注:与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01;与电针组比较，▲P<0.05

4 讨论

环磷酰胺是一种周期特异性烷化剂，主要作用于细胞周期的S期，影响DNA合成。其免疫抑制作用强而持久，能抑制体液免疫和细胞免疫反应[9]。本实验用环磷酰胺制造免疫抑制大鼠模型，大鼠注射环磷酰胺后出现体重减轻、尿血、脱毛等免疫抑制症状。在本研究中，笔者用补法针刺免疫抑制大鼠足三里穴，结果显示：针刺组大鼠体重、脾脏、胸腺指数及白细胞计数与模型组相比显著增加，电针组大鼠体重、胸腺指数与模型组相比显著增加。环磷酰胺具有骨髓抑制作用，可以导致粒细胞减少，针刺组与模型组相比大鼠白细胞计数显著增加，而电针组与模型组相比大鼠白细胞计数虽然增加，但没有统计学意义。胸腺属于中枢免疫器官，脾脏属于外周免疫器官，通过对大鼠脾脏指数与胸腺指数的检测，可以考察针刺对免疫抑制大鼠免疫功能的影响。针刺组与模型组相比脾脏指数与胸腺指数均显著增加，而电针组与模型组相比仅胸腺指数显著增加。《灵枢经》云：“虚实之要，九针最妙，补泻之时，以针为之”。传统针灸的补法、次数与留针时间对疾病的疗效具有重要影响。体现在本研究中，对于免疫抑制大鼠模型的治疗效果，针刺组要优于电针组。

针刺起效的过程可分为局部进针，启动针刺信息，信息沿复杂网络途径传导，最后在靶器官发挥针刺效应等几个环节。其中进针后启动针刺信息为重要的始动环节。通过穴位进针，捻转补泻，引起穴位周边微环境各种特异性应答变化，例如：交感肾上腺髓质系统的兴奋，各种化学介质的释放，不同细胞功能被激活等，最后作用于靶器官，引起靶器官针刺效应[10]。CGRP是感觉神经主要递质，主要由背神经节合成，某些非神经细胞也可表达，如淋巴细胞和内皮细胞。CGRP具有重要的免疫调节作用，可调节多种免疫细胞功能，它可调节离体T淋巴细胞增殖和细胞毒作用，调节T淋巴细胞分泌IL-2和巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6 、IL-12、CXC趋化因子KC和巨噬细胞炎症蛋白-2以及一氧化氮和前列腺素[11-12]。RT-PCR结果显示：电针组和针刺组处理后，穴区CGRPmRNA表达量显著下降，与模型组比较有显著性差异；针刺组下降程度显著高于电针组，两组比较有显著性差异，其原因可能为针刺局部的神经递质CGRP与机体的皮肤树突细胞相互作用，通过分泌相应的细胞因子，影响了T细胞的分化和功能，参与了机体的免疫过程。本研究使中医传统理论与现代医学结合，丰富了神经-内分泌-免疫的研究内容，促进了针灸免疫学这一边缘学科的发展，而CGRP对皮肤树突细胞分化的影响及对机体T细胞应答方向的调控，将是今后研究的重点。

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