电针深刺法对三叉神经痛大鼠电压门控性钾通道的影响*

李崖雪，高瑞雪，王 丰，刘潇，李晓陵 ，闫禹竹，王欣波，孙士红，任佰亮,佟 欣△

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

原发性三叉神经痛(Trigeminal neuralgia,TN)是神经科常见疾病之一，发病率接近 4.5/100 000[1]。因其发病机制不明，故给治疗带来困难。在此疼痛发生过程中P2Y2受体被激活，进而抑制Kv通道亚型表达，促使三叉神经节(Trigeminal，TG)神经元兴奋性增强，产生面部疼痛[2]。本实验运用电针深刺法上调电压门控性钾通道某些亚型的表达情况，从而抑制神经元兴奋性，终止疼痛发生。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性健康成年。SD(Sprague-Dawley)大鼠30只，体质量200～250 g,由黑龙江中医药大学动物中心提供。

1.2 主要仪器与试剂

台式常温离心机(Heraeus公司,德国)，Ultrospec 2000紫外分光光度计(美国公司)，PT-PCR仪(CORBETTRESEARCH公司，澳大利亚),E831型电泳仪(Consort公司,比利时)。

1.3 模型制备

对大鼠进行腹腔麻醉，将其固定。右侧颜面去毛、消毒、铺无菌孔巾。于镜下眉弓上做弧形切口，露出额骨、眼眶以及鼻骨，拨离眶内结构，使眶下神经充分暴露，用镊子缓慢仔细分离眶下神经。结扎眶下神经时采用根铬肠线2根，力度适中，间距约2 mm。压力标准：眶下神经在镜下可见不全阻断其传导，直径稍微变细，神经外膜循环血液通畅。缝合创口置笼内观察。

1.4 模型成立标准

实验员于造模14天后持塑料棒刺激大鼠患侧面部，大鼠出现:①连续3次或以上非对称性搔抓面部;②快速抓咬刺激物等攻击行为;③团身向笼壁靠拢或快速后退。上述反应如出现其中任意1项或l项以上为造模成功。

1.5 研究方法

将30只大鼠随机分为假手术组、电针组和模型组,每组分别为10只。

假手术组：只进行局部皮肤切开(右侧)，不结扎眶下神经。

电针组：成模后采用0.18 mm×13 mm华佗牌不锈钢毫针进行针刺，每日2次，半月为一疗程。选取百会穴，其方向为向后平刺3 mm，选取右侧下关穴，其方向为直刺约5 mm(尽量靠近三叉神经节)，然后连接电针，负极接主穴即下关穴，正极接配穴即百会穴，用80 Hz/s连续波，20 min后停止电针，继续留针10 min后出针。

模型组：采用慢性缩窄环术结扎大鼠眶下神经制备模型。

1.6 检测指标与方法

采用RT-PCR仪分别检测3组大鼠TG中Kv1.4mRNA、Kv3.4mRNA、Kv4.2mRNA、Kv4.3mRNA表达情况。

方法:提取三叉神经节(Trigeminal ganglion,TG)的RNA,溶解在DEPC水20 μL中,然后测吸光值。按照总的RNA浓度,取总RNA1 μg做为模板,并以β-actin为内参，进行RT-PCR。其中Kv1.4K基因有义链引物序列:5′-CATCACTTCCT CCTGCTCTAT-3′,产物377bp,反义链引物序列:5′-CAGTTGTTGGCAATCTTCTTC-3′;Akt基因有义链引物序列:5′-GGACAACCGCCATCCAGACT-3′,产物121bp,反义链引物序列:5′-GCCAGGGACACCTCCATCTC-3′;内参β-actin基因有义链引物序列:5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCC-3′,产物217bp,反义链引物序列:5′-CTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′。Akt、PI3K扩增条件:先进行95℃预变性，持续5 min后进入30个循环(56℃1 min,94℃0.5 min,72℃1 min),最后进行72℃7 min延伸;β-actinPCR扩增条件:先进行95℃预变性，4 min后开始32个循环(62℃1 min,94℃1 min,72℃2 min),最后10 min72℃延伸。PCR扩增产物进行电泳分离(在18 g/L琼脂糖凝胶上)。采用凝胶成像系统对目的电泳条带进行读取，将各组Kv1.4、Kv3.4、Kv4.2、Kv4.3的灰度值标化(以各组β-actin为内参)，之后进行比较。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 TG神经元中心Kv1.4mRNA、Kv4.3mRNA表达比较

术后28天检测模型组、电针组、假手术组大鼠TG中Kv1.4mRNA、Kv4.3mRNA表达的变化,见表1。经电针治疗后，电针组大鼠TG中Kv1.4mRNA、Kv4.3mRNA与模型组相比表达显著增加，具有统计学差异(P<0.05)；与假手术组比较未见显著性差异(P>0.05)。

表1 TG神经元中Kv1.4mRNA、Kv4.3mRNA表达情况比较

注：与模型组比较,*P<0.05；与假手术组比较,△P>0.05

2.2 TG神经元中Kv4.2mRNA、Kv3.4mRNA表达比较

术后28天检测模型组、电针组、假手术组大鼠TG中Kv4.2mRNA、Kv3.4mRNA表达的变化,见表2。经电针治疗后，电针组大鼠TG中Kv4.2mRNA、Kv3.4mRNA与模型组相比表达显著增加，具有统计学差异(P<0.05)；与假手术组比较未见显著性差异(P>0.05)。

表2 TG神经元中Kv4.2mRNA、Kv3.4mRNA表达情况比较

注：与模型组比较,*P<0.05；与假手术组比较,△P>0.05

3 讨论

本项研究选取“下关穴”为主穴，基于此穴为传统经验效穴[3]，现代医学上“下关穴”所在的特殊解剖位置，其下方靠近三叉神经半月节所在处，此神经节受压，脱髓鞘，进而发生神经电生理变化正是本病发生机理(神经压迫学说)[4-5]，同时采用深刺方法，力求最大可能接近三叉神经半月节，达到对此节最大刺激量，纠正电生理改变，恢复其功能。选用“百会穴”为配穴，因其为诸阳之会，总督一身阳经经气，可疏通面部疼痛部位气血，通经而止痛。此研究运用电针深刺法将治疗本病的经验效穴与具有镇痛效应的电针[6-8]方法相结合，结果证实此方法可明显缓解三叉神经痛大鼠疼痛。

在三叉神经痛发生过程中电压门控性钾通道在调节神经末梢释放神经递质的过程中起到重要作用[9-10]。研究表明，在三叉神经痛发作时起作用最明显且最相关的是IA[11]，介导IA的Kv亚型主要是Kv3.4、Kv1.4、Kv4.3以及Kv4.2[12]。钾通道Kv4.3、Kv1.4、Kv4.2、Kv3.4介导IA，通过对IA抑制剂的敏感与否，区分钾通道其它类型[13]。李娜等研究表明在三叉神经痛发生过程中P2Y2 受体被激活，进而抑制Kv通道亚型表达，促使TG神经元兴奋性增强，产生面部疼痛。本研究于术后28天采用PT-PCR技术分别检测假手术组、电针组、模型组大鼠TG中Kv4.3、Kv1.4、Kv4.2、Kv3.4mRNA表达情况。结果显示，经电针深刺治疗后，电针组大鼠TG中Kv4.3、Kv1.4、Kv4.2以及Kv3.4mRNA与模型组相比表达显著增加，具有统计学差异(P<0.05)。说明此方法可以通过增加Kv通道亚型表达，抑制神经元兴奋性，终止三叉神经痛发生，进一步阐明此法治疗三叉神经痛的分子机制。

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