5-羟色胺2C受体对形觉剥夺性成年弱视大鼠离体脑片初级视皮层长时程增强的影响

王娇娇，刘向玲，路承彪，宋子宣，张 锐，张 地

(1.新乡医学院第三附属医院眼科，河南 新乡 453003；2.新乡医学院生理与神经生物学教研室，河南 新乡 453003；3.运城市眼科医院眼科，山西 运城 044000)

视觉发育敏感期内不正常的形觉体验所造成的视力障碍称为弱视[1]，临床上对于成人弱视的治疗存在争议，其治疗效果也不理想。研究发现，成年弱视大鼠长期应用氟西汀可明显逆转眼优势柱的转移，并促进视功能的恢复，但其作用机制尚不明确[2-3]。而5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作为神经递质，需与相应受体结合才能调节突触可塑性[4]。有研究显示，5-羟色胺2C受体(5-hydroxytryptamine-2C subunit receptor，5-HT2CR)在斜视性弱视猫视皮层中的表达较正常猫明显下降[5]。但关于单眼形觉剥夺成年弱视大鼠视皮层中5-HT2CR有何改变，目前国内外报道较少。本研究拟用电生理学方法探讨5-羟色胺盐酸盐和5-HT2CR拮抗剂SB 242084对单眼形觉剥夺成年弱视大鼠离体脑组织切片视皮层V1M区长时程增强(long-term potentiation，LTP)的影响，为临床治疗成人弱视提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组标准清洁级2周龄Spargue Dawley大鼠16只(北京维通利华实验动物技术有限公司)，无眼部疾患，雌雄不限，体质量(22±5)g。将大鼠随机分为正常对照组和单眼形觉剥夺组，每组8只。正常对照组大鼠不做任何处理，单眼形觉剥夺组大鼠行右侧眼睑缝合术制备单眼形觉剥夺性弱视模型。

1.2主要试剂与仪器5-羟色胺盐酸盐(美国Sigma公司)，5-HT2CR拮抗剂SB 242084(美国APExBIO公司)；Hum bug电噪音消除器、Micro1401数模转换器(英国Digitimer有限公司)，MODEL-97拉直仪(美国Sutter Instrument公司)，LEICA VT 1000S振动切片机(美国Leica公司)，MINIPULS-3蠕动泵(美国GILSON公司)，Master-9脉冲刺激器(以色列AMPI公司)，PZMTIII-BS精密立体变倍显微镜(美国WPI公司)，界面式孵育槽、记录槽(自制)。

1.3单眼形觉剥夺性弱视模型的制作单眼形觉剥夺组大鼠乙醚吸入麻醉，自右眼内眦至外眦剪除上、下睑缘约1.5 mm，用6-0眼科缝线间断水平褥式缝合上下睑缘，创缘对齐并涂红霉素眼膏，术后1周每天涂红霉素眼膏，检查创口及母鼠哺乳情况。正常对照组和单眼形觉剥夺组大鼠均于自然光线环境饲养至≥8周龄，再经图形视觉诱发电位(pattern visual evoked potential，P-VEP)检测，单眼形觉剥夺组P100波波形稳定性差、潜伏期延长、振幅降低，提示模型制备成功。

1.4人工脑脊液和切片脑脊液的配制参照文献[6]的方法配制人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)和切片脑脊液。ACSF的成分为：NaCl 126.0 mmol·L-1，KCl 3.0 mmol·L-1，MgSO42.0 mmol·L-1，NaH2PO41.25 mmol·L-1，NaHCO324.0 mmol·L-1，CaCl22.0 mmol·L-1，葡萄糖10.0 mmol·L-1；切片脑脊液成分为：蔗糖225.0 mmol·L-1，KCl 3.0 mmol·L-1，MgSO46.0 mmol·L-1，NaH2PO41.25 mmol·L-1，NaHCO324.0 mmol·L-1，CaCl20.5 mmol·L-1，葡萄糖10.0 mmol·L-1。

1.5大鼠视皮层切片的制备与孵育造模后6周，大鼠用100 g·L-1水合氯醛(3～4 mL·kg-1)进行腹腔注射麻醉，用已通混合氧气(95%O2+5%CO2)且预冷(0 ℃)的切片脑脊液快速心脏灌注，断头取脑，冠状切取400 μm厚视皮层脑组织切片，视皮层的形态辨别参考文献[7]，脑组织切片置于提前通混合氧气≥30 min的ACSF中，孵育1 h待用。

1.6大鼠视皮层切片分组及视皮层V1M区LTP的诱导根据ACSF中加入药物不同，将正常对照组大鼠视皮层切片作为A组(n=8)，将剥夺眼对侧视皮层切片分为B组(n=11)、C组(n=11)、D组(n=5)和E组(n=10)，将剥夺眼同侧视皮层切片分为F组(n=4)、G组(n=4)、H组(n=8)和I组(n=4)。A、B、F组人工脑脊液不加任何药物，C、G组加生理盐水，D、H组加10 μmol·L-15-羟色胺盐酸盐，E、I组加10 μmol·L-1SB 242084和10 μmol·L-15-羟色胺盐酸盐。记录槽内放置1张视皮层切片，通有混合氧气的ACSF(28～32 ℃)持续灌流入记录槽，速度为3～4 mL·min-1。电极放置的位置参照文献[8-9]：视皮层V1M区第Ⅱ/Ⅲ层放置充有ACSF的玻璃记录电极，电阻为2～3 MΩ；视皮层第Ⅳ层放置由2根直径为75 μm镍铬合金丝自制而成的刺激电极，Master-9脉冲刺激器输出刺激(波宽：50 μs；频率：0.1 Hz)，记录基础刺激之前先检测刺激强度与神经元场突触后电位(field postsynaptic potential，fPSP)的关系，最适刺激强度约为最大反应的40%～60%所对应的刺激强度，待fPSP稳定达10 min后，给予最适刺激强度的强直高频刺激(high frequency stimulation，HFS)(100 Hz)诱导LTP，刺激参数维持恒定，持续记录1 h。选取fPSP下行波振幅的10%和50%计算fPSP斜率，设定基础刺激(10 min)fPSP斜率为100%，对HFS后 (51～60 min) fPSP斜率的变化进行分析。

2 结果

各组大鼠视皮层fPSP斜率比较结果见图1、图2、图3。A、B、C、D、E、F、G、H、I组大鼠视皮层fPSP斜率分别为(198.1±13.5)%、(106.3±8.3)%、(106.3±8.3)%、(157.1±9.7)%、(102.6±4.7)%、(144.5±2.9)%、(144.5±2.9)%、(192.2±8.6)%和(129.7±13.5)%。A、B、F组大鼠视皮层fPSP斜率两两比较差异均有统计学意义(P<0.001);A组大鼠视皮层fPSP斜率高于B、F组，B组大鼠视皮层fPSP斜率低于F组(P<0.001)。D组大鼠视皮层fPSP斜率高于C组，差异有统计学意义(t=-10.833，P<0.001)；H组大鼠视皮层fPSP斜率高于D、G组，差异有统计学意义(t=-6.841、-10.616，P<0.001)；E组大鼠视皮层fPSP斜率低于D、I组，差异有统计学意义(t=11.872、-3.910，P<0.001，P<0.05)；I组大鼠视皮层fPSP斜率低于H组，差异有统计学意义(t=9.911，P<0.001)。

图1A、B、F组大鼠视皮层fPSP斜率

Fig.1fPSPslopeofthevisualcortexofratsingroupA，B，F

A：剥夺眼对侧视皮层；B：剥夺眼同侧视皮层；：C组；：D组；：G组；：H组；：代表HFS。

图25-羟色胺盐酸盐对HFS诱导的单眼形觉剥夺大鼠双侧视皮层fPSP斜率的影响

Fig.2Effectof5-hydroxytryptaminehydrochlorideonthefPSPslopeofthebilateralvisualcortexinmonoculardeprivationratsinducedbyHFS

图3SB242084联合5-羟色胺盐酸盐对HFS诱导的单眼形觉剥夺大鼠双侧视皮层fPSP斜率的影响

Fig.3EffectofSB242084combined5-hydroxytryptaminehydrochlorideonthefPSPslopeofthebilateralvisualcortexinmonoculardeprivationratsinducedbyHFS

3 讨论

哺乳动物在胚胎时期视觉神经系统已经开始发育并持续至出生后，出生睁眼后，光线通过正常屈光间质刺激视网膜双极细胞产生神经冲动并传导至视皮层，进一步促进视觉系统的发育[10]。大鼠视觉系统发育的关键期为出生后第14～45天，而成年期一般为出生后第8～48周龄[11]。研究表明，随着视觉系统发育关键期的结束，成年鼠仍具有突触可塑性，而非既往认为的随着关键期的结束可塑性也终止[12-13]。据此，本实验选择出生后2周龄未睁眼大鼠行右侧眼睑缝合术，饲养至≥8周龄，建立单眼形觉剥夺性成年弱视大鼠模型。

既往研究表明，在视皮层第Ⅱ/Ⅲ层成功诱导LTP需要N-甲基-D-天冬氨酸受体(n-methyl-d-aspartic acid receptor，NMDAR)和α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor，AMPAR)的参与[13]。当视皮层第Ⅳ层神经元受到电流刺激后，突触前神经元释放谷氨酸递质并与突触后膜上的NMDAR和AMPAR结合，AMPAR被激活使NMDAR通道中的Mg2+移出，大量Na+和Ca2+进入细胞，AMPAR通道磷酸化，电导增加，最终在视皮层第Ⅱ/Ⅲ层成功诱导出LTP[14]。以往有关视皮层LTP的诱导多采用TBS刺激模式，鉴于成年大鼠突触可塑性下降，LTP不易被诱导。因此，本实验采用脉宽较小且频率较高的HFS来诱导成年大鼠视皮层LTP，以fPSP斜率作为观测指标。

5-HT是一种重要的胺类神经递质，广泛存在于哺乳动物的视网膜和视皮层[15]，其与相应受体结合可诱导长期突触可塑性和眼优势可塑性，它与脑内的多巴胺、肾上腺素、乙酰胆碱等递质间也存在复杂的相互拮抗和相互协同的关系[16]。啮齿类动物初级视皮层密集分布着5-HT轴突纤维，这些纤维来源于中缝核，并将其投射到整个前脑，尤其视皮层V1M区[17]。蔺静静等[18]研究认为，丰富环境主要通过刺激感觉运动的方式再次激活成年弱视大鼠视皮层突触可塑性。BARONCELLI等[19]通过高效液相色谱分析法发现，处于丰富环境的弱视大鼠视皮层5-HT含量较正常环境大鼠含量明显升高。也有研究发现，出生后90 d内一直处于丰富环境状态下的成年雄性大鼠视皮层中含有大量5-HT，而雌性大鼠视网膜较多；出生后第90～150天内处于丰富环境的成年大鼠视网膜和视皮层中均有大量5-HT，且无性别差异[15]。综上所述，5-HT与成年大鼠视皮层突触可塑性有相关性，这也和本研究结果5-羟色胺盐酸盐可提高成年弱视大鼠视皮层fPSP斜率相一致。PALACIOS等[20]应用光镜放射定量自显影、基因克隆和原味杂交等技术发现，5-HT受体类型复杂，多达14个亚型，其中5-HT2CR可通过激活突触可塑性关键酶——磷酸肌醇特异性磷脂酶C(phosphatidylinositol-phospholipases C，PI-PLC)调整中枢神经系统的活动，而且5-HT2CR在视皮层17区分布也很广泛，该受体与NMDAR、脑源性神经营养因子也存在联系。因此，本实验选用SB 242084和 5-羟色胺盐酸盐进行干预，观察它们对弱视大鼠视皮层V1M区LTP的影响，从而印证5-HT2CR参与视觉可塑性的变化。

视皮层V1M区称为初级视皮层区，负责加工、处理视觉信息，也是最早参与视觉组织活动的结构[7]。目前公认的视皮层上层神经回路主要有2种：一种是从视皮层第Ⅳ层到第Ⅱ/Ⅲ层的垂直连接方式，另一种是从第Ⅱ/Ⅲ层到第Ⅱ/Ⅲ层的长距离水平连接方式，2种连接方式均是功能相似神经元相互联系的固有形式，而这2种途径在成熟模式方面存在差异，但均能通过中间神经元成功诱发突触反应。LI等[9]研究发现，在相同刺激模式下，垂直方向诱导LTP的振幅明显高于水平方向，但水平方向刺激锥体神经元诱导LTP振幅达最大所用时间最短，因此，他们认为水平方向连接的神经纤维较垂直方向成熟更早更快。因而本实验将视皮层V1M区第Ⅳ层放置刺激电极，第Ⅱ/Ⅲ层放置记录电极，采用垂直方向诱导LTP，以进一步研究视皮层突触可塑性的机制。

本研究发现，单眼形觉剥夺成年弱视大鼠剥夺眼对侧视皮层fPSP斜率较同侧视皮层fPSP斜率小，这可能是由于约90%的大鼠视觉神经纤维在视交叉交叉于对侧，但相对于正常大鼠视皮层 fPSP斜率则明显降低，说明关键期行单眼形觉剥夺至成年期对大鼠双侧视皮层神经传递均起抑制作用，进一步推断成年弱视大鼠视皮层经验依赖眼优势可塑性受到影响。为恢复成年弱视大鼠视皮层突触可塑性，本研究观察了5-羟色胺盐酸盐对视皮层LTP的影响，结果显示，在成年弱视大鼠剥夺眼对侧视皮层V1M区可成功诱导LTP，fPSP斜率较用药前明显增高；剥夺眼同侧视皮层fPSP斜率较用药前有一定增高，但均未达到正常水平，证明5-羟色胺盐酸盐在一定程度上可恢复成年弱视大鼠视皮层眼优势可塑性，这也与MAYA等[3]的观点相一致。进一步应用5-HT2CR拮抗剂SB 242084，发现其可抵消5-羟色胺盐酸盐对剥夺眼对侧视皮层fPSP斜率的助长作用，而剥夺眼同侧视皮层fPSP斜率也有一定程度下降，证明5-羟色胺盐酸盐主要通过5-HT2CR来恢复成年弱视大鼠视皮层眼优势可塑性，且PARK等[11]的研究结果与之相似。本研究中，部分视皮层切片HFS后fPSP斜率较基线明显升高，随即出现降低的现象，可能原因为大鼠脑组织切片活性下降，且本实验样本量较小，需进一步增加样本量研究。

参考文献：

[1] PAN C W，CHEN X，ZHU H，etal.School-based assessment of amblyopia and strabismus among multiethnic children in rural China[J].ScientificReports，2017，7(1)：1-7.

[2] BALOG J，MATTHIES U，NAUMANN L，etal.Social experience modulates ocular dominance plasticity differentially in adult male and female mice[J].Neuroimage，2014，103(2014)：454-456.

[3] MAYA VETENCOURT J F，SALE A，VIEGI A，etal.The antidepressant fluoxetine restores plasticity in the adult visual cortex[J].Science，2008，320(5874)：385-388.

[4] GAGOLEWICZ P J，DRINGENBERG H C.Age-dependent switch of the role of serotonergic 5-HT1A receptors in gating long-term potentiation in rat visual cortexinvivo[J].NeuralPlast，2016，2016：1-11.

[5] 刘虎，赵堪兴.斜视性弱视视皮层神经元时空特性的改变及其相关机制研究[D].天津：天津医科大学，2004.

[6] WANG J，ZHAO J，LIU Z，etal.Acute ethanol inhibition of gamma oscillations is mediated by Akt and GSK3β[J].FrontCellNeurosci，2016，10(17)：1-12.

[7] 张锐，刘向玲，路承彪，等.Ⅰ组代谢性谷氨酸受体在单眼形觉剥夺大鼠视皮层神经元突触传递效能中的作用[J].中华实验眼科杂志，2016，34(4)：293-297.

[8] SUGIMURA T，YAMAMOTO M，YAMADA K，etal.Visual experience regulates the development of long-term synaptic modifications induced by low-frequency stimulation in mouse visual cortex[J].NeurosciRes，2017，102(17)：36-44.

[9] LI D K，ZHANG C，GU Y，etal.The spatial-temporal interaction in the LTP induction between layer Ⅳ to layer Ⅱ/Ⅲ and layer Ⅱ/Ⅲ to layer Ⅱ/Ⅲ connections in rats′ visual cortex during the development[J].Neuroscience，2017，350(14)：39-53.

[10] JEFFERIS J M，CONNOR A J，CLARKE M P.Amblyopia[J].BMJ，2015，351(12)：h5811.

[11] PARK S W，JANG H J，CHO K H，etal.Developmental switch of the serotonergic role in the induction of synaptic long-term potentiation in the rat visual cortex[J].KoreanJPhysiolPharmacol，2012，16(1)：65-70.

[12] LIU H，LI Y，WANG Y，etal.The distinct role of NR2B subunit in the enhancement of visual plasticity in adulthood[J].MolecularBrain，2015，8(19)：2-12.

[13] MAINARDI M，LANDI S，GIANFRANCESCHI L，etal.Environmental enrichment potentiates thalamocortical transmission and plasticity in the adult rat visual cortex[J].JNeurosciRes，2010，88(14)：3048-3059.

[14] KIM H S，JANG H J，CHO K H，etal.Serotonin inhibits the induction of NMDA receptor-dependent long-term potentiation in the rat primary visual cortex[J].BrainRes，2006，1103(1)：49-55.

[15] BESSINIS D P，DALLA C，KOKRAS N，etal.Sex-dependent neurochemical effects of environmental enrichment in the visual system[J].Neuroscience，2013，254(19)：130-140.

[16] JANG H J，CHO K H，JOO K，etal.Differential modulation of phasic and tonic inhibition underlies serotonergic suppression of long-term potentiation in the rat visual cortex[J].Neuroscience，2015，301(20)：351-362.

[17] PAPADOPOULOS G C，PARNAVELAS J G，BUIJS R M.Light and electron microscopic immunocytochemical analysis of the serotonin innervation of the rat visual cortex[J].JNeurocytol，1987，16(6)：883-892.

[18] 蔺静静，刘向玲，王圆月，等.丰富环境及反转缝合治疗后突触素对关键期内视皮质神经元可塑性的影响[J].眼科新进展，2015，35(4)：330-333.

[19] BARONCELLI L，SALE A，VIEGI A，etal.Experience-dependent reactivation of ocular dominance plasticity in the adult visual cortex[J].ExpNeurol，2010，226(1)：100-109.

[20] PALACIOS J M.Serotonin receptors in brain revisited[J].BrainRes，2016，1645(15)：46-49.