CXCL8在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

陈晓燕，罗金键

(郑州大学附属郑州中心医院消化内科，河南 郑州 450000)

结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，是全世界第3大最常见的癌症，是癌症导致死亡的第2大主要原因[1-2]。诊断为结直肠癌的患者在6 a内大约50%死于远处转移[3]。随着人们生活方式、饮食习惯的改变及其他危险因素的增加，结直肠癌的发病率呈上升趋势。尽管结直肠癌的诊断技术和治疗方法不断提高，但是早期患者术后复发率及中晚期患者放射治疗、化学治疗后的生存期均未得到明显改善。近年来，一些重要的肿瘤相关基因被发现，逐渐用于肿瘤基因治疗及靶向药物治疗等。在这个过程中寻找一个关键的治疗靶点，即肿瘤相关癌基因非常重要。目前，肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[4]，而CXCL8在其中是比较重要的免疫抑制因子[5-6]，CXCL8在甲状腺癌及卵巢癌中均能够促进癌细胞的侵袭、迁移及转移[7-8]。而CXCL8在结直肠癌中的表达及发挥的作用尚未详细地阐述，因此，本研究拟探讨CXCL8在结直肠癌中的表达，分析其与结直肠癌患者临床病理参数的相关性，进一步阐述CXCL8是否可以作为结直肠癌患者的理想免疫治疗靶点。

1 资料和方法

1.1一般资料选取2014年11月至2016年11月于郑州大学附属郑州中心医院胃肠外科行手术切除的60例结直肠癌患者的癌组织及对应的癌旁正常黏膜组织(癌旁组织)为研究对象。所有病例均经病理学确诊，术前均未行放射、化学治疗等干预。所有标本均在手术进行中收集且经患者知情同意。

1.2主要试剂与仪器RNAiso plus、反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ购自日本TAKARA公司，免疫组织化学试剂盒购自中国东源生物科技有限公司，CXCL8单克隆抗体购自英国Abcam公司。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪购自美国Agilent公司，高通量组织破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司，Nanodrop核酸蛋白测定仪购自美国Thermo Scientific公司，倒置显微镜购自美国Leika公司，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。内参磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，引物大小138 bp；CXCL8上游引物序列：5′-GTTGTAGGGTTGCCAGATGC-3′，下游引物序列：5′-TTCTCCCGTGCAATATCTAGG-3′，引物大小190 bp。

1.3实时荧光定量聚合酶链反应检测CXCL8mRNA在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达将结直肠癌组织和癌旁组织分别匀浆后室温静置 5 min；4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min，取上清液；加入500 μL氯仿，震荡2 min，室温孵育5 min；4 ℃ 12 000 r·min-1，离心15 min，取上清液；加入 500 μL 异丙醇，震荡2 min，室温孵育10 min；4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，加1 mL体积分数75%乙醇，涡旋混匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min，弃上清液；干燥后加适量焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水溶解RNA。Nanodrop核酸蛋白测定仪检测RNA浓度及纯度。反转录反应严格按照试剂盒说明书操作，反应条件为 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃短暂保存；得到的cDNA于-20 ℃ 冻存备用。以反转录提取的cDNA作为模板，应用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行PCR；反应条件为95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40个扩增循环；应用美国Agilent Mx3005P仪器行定量检测和溶解曲线分析，每个样本反应均设3个复孔。实验均重复3次，计算均值。

1.4免疫组织化学染色法检测CXCL8蛋白在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达分别固定组织，包埋，烤片；将切片依次在8 mol·L-1二甲苯中浸泡15 min，体积分数100%、95%、90%、80%、70%、60%、50% 乙醇梯度脱水；流水冲洗2 min，抗原修复，室温冷却 2 h；体积分数3%过氧化氢室温孵育10 min。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS) 洗3次；滴加试剂 A封闭，室温孵育 30 min；滴加一抗50～70 μL，湿盒中4 ℃孵育过夜；室温恢复1 h，PBS洗4次；滴加试剂 B，室温孵育30 min；PBS洗1次；滴加试剂C，孵育 15 min，PBS 洗3次；滴加50 μL新配制二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)，显色0.5～2.0 min，流水冲洗2 min终止显色；滴加 50 μL 苏木精，染色15 min，流水冲洗 10 min；依次在体积分数 50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% 乙醇中浸泡 1 min，二甲苯中浸泡 15 min；中性树胶封片；拍照并保存图像。免疫组织化学结果判读：由2名经验丰富的病理科医师对结果进行判定。CXCL8蛋白阳性表达呈棕黄色，主要定位于细胞膜和(或)细胞质中。在400倍镜下观察，随机取5个视野，采用染色强度和阳性细胞百分比进行评分；染色强度分为4级，阴性：0分；弱阳性：1分；阳性：2分；强阳性：3分。阳性细胞百分比分为5级，0分：阳性细胞<5%；1 分：5%≤阳性细胞<25%；2分：25%≤阳性细胞<50%；3分：50%≤阳性细胞<75%；4分：阳性细胞≥75%。染色强度和阳性细胞百分比所得分数乘积即为每张切片的得分；0～1分：阴性(﹣)；2～3分：弱阳性(+)；≥4分：阳性(++)。弱阳性和阳性统一判定为阳性。

2 结果

2.1CXCL8mRNA在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达CXCL8 mRNA在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达分别为157.6±26.2和 42.7±9.6，CXCL8 mRNA在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2CXCL8蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达结果见图1。在癌旁组织中，CXCL8阴性表达45例(75.0%)，弱阳性表达15例(25.0%)；在癌组织中，CXCL8阴性表达10例(16.7%)，阳性表达50例(83.3%)。CXCL8蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=41.10，P<0.01)。

A：癌旁组织；B：癌组织。

图1CXCL8在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达(免疫组织化学法，×400)

Fig.1ExpressionofCXCL8incolorectaltumortissuesandmarginaltissues(immunohistochemicalmethod，×400)

2.3CXCL8与结直肠癌患者临床病理参数的相关性分析结果见表1。CXCL8在结直肠癌组织中的表达与淋巴结转移、肿瘤分期有关(P<0.01，P<0.05)，与年龄、性别及结直肠癌分化程度无相关性(P>0.05)。

表1CXCL8与结直肠癌患者临床病理参数的相关性分析

Tab.1CorrelationanalysisbetweenCXCL8andclinicopathologicalparametersofpatientswithcolorectalcancer

变量nCXCL8阴性/例(%)弱阳性或阳性/例(%)χ2P年龄 ≤60岁2111(52.4)10(47.6)0.24>0.05 >60岁3923(59.0)16(41.0)性别 男3821(55.3)17(44.7)0.07>0.05 女2213(59.1)9 (40.9)淋巴结转移 未转移3331(93.9)2(6.1)41.40<0.01 转移273 (11.1)24(88.9)肿瘤分期 Ⅰ～Ⅱ期3830(78.9)8 (21.1)21.10<0.05 Ⅲ～Ⅳ期224 (18.2)18(81.8)分化程度 Ⅰ2516(64.0)9 (36.0)0.90>0.05 Ⅱ～Ⅲ3518(51.4)17(48.6)

3 讨论

结直肠癌发病率极高，从全球来看，每年诊断为结直肠癌的病例大约140万，约60.8万患者发生死亡[9]。在过去的十年中，尽管结直肠癌的诊断及治疗已经取得了进展，但是，结直肠癌患者的整体生存率并没有显著提高[10]。结直肠癌是由于表观遗传及基因改变导致的，主要包括致癌基因、肿瘤抑制基因、错配修复基因及结肠黏膜细胞中的细胞周期调控基因，这些因素的改变会推动结直肠癌发生及发展的关键途径[9-10]。

肿瘤微环境在肿瘤的发生及发展过程中起着重要作用[4]，在肿瘤微环境中除了肿瘤细胞外，还有多种免疫抑制因子和免疫抑制细胞，它们均能促进肿瘤的进展[11-12]。有文献报道，细胞因子参与了肿瘤的发生和转移[13]。有研究报道，CXCL8能够促进卵巢癌细胞的侵袭及转移[8]，也能促进胃癌的进展[14]，同时CXCL8还可以预测胰腺癌患者的预后[15]。在结直肠癌中，肿瘤细胞能够选择性上调细胞因子的表达[16-17]，并且，有大量临床研究表明，细胞因子在结直肠癌的发生、发展及转移过程中发挥了重要的作用[18]。本研究结果显示，CXCL8蛋白和mRNA在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织，并且CXCL8在发生淋巴结转移、肿瘤分期为 Ⅲ～Ⅳ期的结直肠癌患者中的阳性表达率均明显高于未发生淋巴结转移及肿瘤分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，故作者认为CXCL8与结直肠癌的发生、发展相关。

综上所述，CXCL8在结直肠癌的发生及发展过程中发挥了重要作用，可能作为判断结直肠癌患者预后的一个指标。

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