血红素加氧酶1对2型糖尿病肾病大鼠肾脏功能影响的研究*

罗喜钢，王毅，张凤香

（1.锦州医科大学附属第三医院 检验中心，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院 胸外科，辽宁 锦州 121001）

血红素加氧酶1（heme oxygenase-1,HO-1）活性对热较稳定，又被称为热休克应激反应蛋白32，是HO亚型中的可诱导型。在正常的情况下，机体内各种组织器官中的HO-1表达水平极低，当机体受到一些刺激因素时其表达水平和生物活性会有所提高。其中能够刺激HO-1产生的活化信号分子包括血红素、内毒素、活性氧和生长因子等。在上述诱因下可诱导HO-1生成[1]，而锌原卟啉等物质对其有抑制作用。血红素在其限速酶HO-1的催化下可以代谢生成CO、铁离子和胆绿素，胆绿素经过还原酶的作用生成胆红素[2]。近年来研究发现[3]，HO-1与其代谢产物有一定的抗炎、抗凋亡、舒张血管等作用。HO-1在许多疾病中都起重要的保护作用，抑制肾脏HO-1活性会导致肾脏血流灌注减少加重肾功能不全，提高HO-1活性恰恰与其相反。

本实验通过复制2型糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）大鼠模型，使用HO-1诱导剂氯化血红素和抑制剂锌原卟啉对大鼠模型进行药物干预后，分析不同组别大鼠肾脏损伤程度与肾脏中HO-1表达之间的关系，探讨HO-1对2型糖尿病肾病肾脏损伤是否具有保护作用，为2型糖尿病导致的肾脏损伤提供新的治疗思维方式。

1 材料与方法

1.1 一般资料

200～250 g健康清洁6周龄雄性SD大鼠32只，辽宁长生生物技术有限公司供给，合格证：SCXK（辽）2010-0001，分笼饲养。氯化血红素、锌原卟啉（美国Sigma公司），HO-1多克隆抗体、免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）。

1.2 方法

大鼠尾静脉注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）复制DN模型，72 h后用快速血糖仪测血糖，其中≥16.65 mmol/L的大鼠入选实验组。确定模型复制成功后，各组大鼠分别进行药物干预。氯化血红素是HO-1的诱导剂，DN氯化血红素组大鼠腹腔注射氯化血红素30 μmol/kg，1次/2 d，连续4周；锌原卟啉是HO-1抑制剂，DN锌原卟啉组大鼠腹腔注射锌原卟啉10 μmol/kg，1次/2 d，连续4周；正常对照组和DN组大鼠腹腔注射等剂量的生理盐水。氯化血红素与锌原卟啉溶液均需现用现配以免药物失效，药物需要避光配制。使用0.2 mol/L的氢氧化钠NaOH溶液对药品进行充分的溶解后，0.2 mol/L的氯化氢HCl调节pH值至7.4～8.0。

大鼠腹腔用药4周后，分别收集各组大鼠24 h尿液。根据大鼠的体重腹腔注射一定量的10%水合氯醛充分麻醉大鼠，待大鼠麻醉后固定大鼠的四肢于手术台上，取血3 ml，将血液缓慢推入一次性试管中，静止一段时间，当有血块凝集后，以3 000 r/min离心10 min后轻轻取出试管，使用移液器将上层血清转移至无菌EP管中。使用全自动生化分析仪检测各组大鼠血中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、血肌酐（serum creatinine,Scr）、尿肌酐（urine creatinine,Ucr）和胱抑素C（cystatin-c,Cys-c）浓度，计算内生肌酐清除率（creatinine clearance,Ccr），做相关性分析。

取血后开腹取大鼠的肝脏和肾脏组织，双侧肾脏使用大量生理盐水反复洗至颜色苍白为止，取大鼠左侧部分肾脏组织将其修饰为5 mm×5 mm×5 mm左右的组织块，迅速置于10%甲醛中固定，用于HE染色、免疫组织化学分析，同时取1 mm×1 mm×1 mm的组织块，2%戊二醛和1%锇酸固定，用于电镜观察。取右侧肾脏立即放置到-80℃冰箱中用于Western blot检测。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠生化指标比较

经单因素方差分析，4组大鼠Scr、Cys-c、Ucr、Ccr比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组比较，DN组、DN氯化血红素组和DN锌原卟啉组Scr、Ucr、Cys-c、Ccr、Cys-c比较，差异有统计学意义（P＜0.05），DN 组 Scr、Cys-c升高（t=7.021 和 27.502，P=0.004和 0.001），Ucr、Ccr降低（t=-6.143和-5.604，P=0.007和0.008）。与DN组比较，DN氯化血红素组的Scr、Cys-c降低（t=5.041和11.893，P=0.007和0.003），Ucr、Ccr增高（t=-3.922和 -3.623，P=0.009和0.015）。与DN组比较，DN锌原卟啉组Scr、Cys-c增高（t=-13.924和-6.391，P=0.003和 0.009），Ucr、Ccr降低（t=2.481和7.183，P=0.021和0.006）。见附表。

2.2 肾脏组织形态学改变

光镜下可观察到对照组大鼠肾脏组织结构正常，肾小球基底膜厚度均匀，足突细胞排列有序；DN组大鼠肾小球与肾小管结均有改变，肾小管上皮细胞排列不整齐，并且有肿胀，脱落等现象，在肾小管中还可见有管型生成，肾小球基底膜增厚，肾小球有一定程度上的萎缩；DN氯化血红素组大鼠肾小管上皮细胞浊肿，空泡样的变性，刷状缘丢失；DN锌原卟啉组大鼠肾小管和肾小球的病变最为严重，可见肾小管管腔扩大，上皮细胞水肿变性，大量的脱落，细胞质和线粒体中有空泡形成，肾小球萎缩，鲍曼囊腔扩大，肾小球基底膜不均匀的增厚，足突细胞大量的融合。见图1～3。

2.3 肾脏中HO-1表达水平

Western blot结果显示，正常对照组大鼠肾脏中有一定量的HO-1表达；DN组大鼠肾脏中HO-1的表达较正常对照组大鼠降低；DN氯化血红素组大鼠肾脏中HO-1表达高于其他各组；DN锌原卟啉组大鼠肾脏中几乎没有HO-1的表达。见图4。

附表 各组大鼠 Scr、Ucr、Ccr、Cys-c 比较 （n =8，±s）

附表 各组大鼠 Scr、Ucr、Ccr、Cys-c 比较 （n =8，±s）

注：1）与正常对照组比较，P ＜0.05；2）与DN组比较，P ＜0.05；3）与DN氯化血红素组比较，P ＜0.05

组别 Scr/（μmol/L） Ucr/（mmol/L） Ccr/（ml/min） Cys-c/（mg/L）正常对照组 35.59±1.35 9.72±1.12 4.21±0.79 0.24±0.03 DN组 70.52±5.211） 6.42±0.931） 2.40±0.371） 0.75±0.041）DN氯化血红素组 50.96±2.131）2） 8.55±1.031）2） 3.40±0.621）2） 0.50±0.031）2）DN 锌原卟啉组 110.18±8.251）2）3） 5.02±1.121）2）3） 1.03±0.301）2）3） 0.91±0.051）2）3）F值 251.315 27.325 38.781 436.206 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

图1 肾脏组织形态 （HE染色×200）

图2 肾小管组织形态 （电镜×10 000）

图3 肾小球组织形态 （电镜×5 000）

图4 肾脏HO-1蛋白表达

3 讨论

HO-1是血红素代谢过程中的关键酶[4]，也是器官、组织、细胞受损后机体内重要的保护性酶。HO-1具有抗炎、抗凋亡、抗氧化和维持应激状态下细胞稳定性的作用[5]。此外，现已公认HO-1在血液循环系统具有重要的作用，是潜在的血管调节器[6]。本实验通过药物干预改变DN大鼠肾脏内HO-1的表达水平，DN氯化血红素组大鼠通过腹腔注射氯化血红素来增加肾脏中HO-1的生成，DN锌原卟啉组大鼠通过腹腔注射锌原卟啉减少肾脏HO-1生成。免疫组织化学和Western blot实验结果显示正常对照组大鼠肾脏中有少量HO-1表达；DN组大鼠肾脏中的HO-1表达较正常对照组降低；DN氯化血红素组大鼠肾脏中有大量的HO-1表达于肾小管上皮细胞；DN锌原卟啉组大鼠肾脏内几乎没有HO-1的表达。

总之，本实验结果表明提高DN大鼠肾脏中HO-1的表达，可以提高肾脏滤过功能并减轻肾脏组织形态的损伤程度，在一定程度上改善了肾功能。相反，减少DN大鼠肾脏中的HO-1的表达水平，肾脏内Ccr下降，肾小管和肾小球都有一定程度上的损伤，并且小管的损伤程度较肾小球严重，但是确切的作用机制仍不完全清楚，需要进一步去探究验证。

[1]ZHU K,GUO X,PENG W,et al.Protective effects of wheat germ protein isolate hydrolysates (WGPIH) against hydrogen peroxideinduced oxidative stress in PC12 cells[J].Food Res,2013,53(5):297-303.

[2]WONG P,MURRAY C,LOUW J,et al.Adult bronchopulm- onary dysplasia: computed tomography pulmonary findings[J].J Med Imaging Radiat Oncol,2011,55(7): 373-378.

[3]STEFANSON A,BAKOVIC M.Dietary regulation of Keap1/Nrf2/ARE pathway: focus on plant-derived compounds and trace minerals[J].Nutrients,2014,6(8): 3777-3801.

[4]IHO S,MAEYAMA J,SUZUKI F.CpG oligodeoxynucleotides as mucosal adjuvants[J].Hum Vaccin Immunother,2015,11(4): 755-760.

[5]SCHEIERMANN J,KLINMAN D M.Clinical evaluation of CpG oligonucleotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases and cancer[J].Vaccine,2013,32(5): 6377-6389.

[6]GAO H,MENG J,XING H,et a1.Association of heme oxygenase-1 with the risk of polycystie ovary syndrome in nonobese women[J].Hum Reprod,2014,29(5): 1058-1066．