牡荆素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

蒙传任，林稚凤，邢红宇

（1.海南省海口市第四人民医院 检验科，海南 海口 571100；2.海南省中医院 检验科，海南 海口 570311）

细菌能黏附于物体表面，并分泌细胞外基质将自身包裹，形成生物膜。生物膜状态下的细菌具有更强的生存能力，能抵抗环境中的各种不利因素[1]。此外，生物膜还能抑制抗生素的渗透作用，极大的增加了细菌的耐药性[2]。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa）被认为是能导致人体生物膜相关感染的最具危害性的病原菌，常导致一系列疾病，如：尿路感染、肾脏感染和肺囊性纤维化等[3]。近年来，随着P.aeruginosa耐药性的增高，传统抗生素往往难以根除已形成的生物膜，因此，从自然界中发掘新的抗菌药物已成为当前研究的热点。

牡荆素（Vitexin,Vite）是一种分离自牡荆属植物的一种多酚类化合物，具有一定的抑制细菌生物膜形成的能力。然而，单独使用Vite并不能达到最佳抗生物膜效果[4]。因此，本研究诣在探讨Vite与传统抗生素联合使用对P.aeruginosa生物膜的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源与培养条件P.aeruginosa标准菌株PAO1购买自美国ATCC标准菌株保存库，于-80℃冰箱保存，使用前室温解冻，并在血琼脂平板培养基上划线接种，过夜培养后调取单个菌落划线接种传2代以获得相对稳定状态的菌株。

1.1.2 主要试剂与设备 TSB肉汤和Muller-HintonⅡ（MH Ⅱ）肉汤均购自美国BD公司，Vite、头孢他啶（CAZ）、环丙沙星（CIP）、左旋氧氟沙星（OFLX）和庆大霉素（GEN）均购自美国Sigma公司，结晶紫颗粒购自天津市化学试剂一厂，96孔无菌细胞培养板和多功能酶标仪等设备均由海南省海口市第四人民医院检验科提供。

1.2 方法

1.2.1 药物敏感实验 用MH Ⅱ肉汤倍比稀释各抗生素储备液后分别加入100 μl至96孔板中的各孔，作为实验组，同时分别设置阴性对照组（未加抗生素仅加培养基和细菌）和对照组（仅加培养基）。挑取血琼脂平板培养基上过夜培养的单个菌落，用生理盐水调为0.5麦氏浊度，再用MH Ⅱ肉汤按1∶20进行稀释，分别向加了抗生素的各孔中加入10 μl已稀释好的菌悬液，使最终实验菌浓度约为5×105CFU/ml。置于恒温培养箱中37℃孵育16 h，读取结果。最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）终点即为肉眼所见能完全抑制细菌生长的抗菌药物的最高稀释度[5]。

1.2.2 浮游菌生长曲线的绘制 PAO1于血琼脂平板过夜培养后，调取单个菌落，用生理盐水调节浓度至0.5麦氏浊度，3组分别加入系列已配备好的用LB肉汤稀释的Vite溶液中（62.5、125.0、250.0 μg/ml），于37℃恒温摇床180 r/min摇菌培养，每隔8 h，各吸取200 μl菌悬液于96孔板中，测量600 nm处的吸光密度值，连续监测24 h，绘制时间-生长曲线。

1.2.3 生物膜形成抑制实验 用LB肉汤倍比稀释Vite母液至实验浓度（1 000.00～15.63 μg/ml），分别加入198 μl至96孔板中的各孔，备用。PAO1于血琼脂平板培养基过夜培养后，调取单个菌落于装有LB肉汤的离心管中过夜摇菌培养，用生理盐水将菌悬液浓度调为约1麦氏浊度。再分别加2 μl菌悬液于备用的96孔板中，37℃恒温培养箱中静置孵育24 h后，弃去浮游菌，用生理盐水轻洗2遍，再分别加入200 μl 0.1%结晶紫溶液染色15 min，弃去未与板壁细菌结合的结晶紫溶液，并用生理盐水轻洗3遍后，分别加入200 μl无水乙醇，以溶解与细菌结合的结晶紫，并于570 nm处进行比色[6]。

1.2.4 Vite与抗生素联用对生物膜的影响 用LB肉汤分别稀释Vite和各抗生素母液至实验浓度，使Vite与抗生素混合后Vite的终浓度为31.25 μg/ml，而CIP、GEN、CAZ和OFLX的终浓度分别为0.25、0.50、0.25和1.00 μg/ml。其余部分同上。

1.3 统计学方法

数据分析采用GraphePad Prism 6.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组独立样本的差异采用两独立样本t检验，多组间的比较采用方差分析，若方差齐则两两间的比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Vite对PAO1浮游菌生长的影响

不同浓度Vite与阴性对照组比较，250.0 μg/ml的Vite能部分抑制PAO1浮游菌的生长，差异有统计学意义（F=168.800，P=0.000）。实验组Vite作用16和24 h可分别使细菌的生长量（OD600nm）从（0.35±0.01）和（0.49±0.02）减少到（0.17±0.03）和（0.26±0.03），差异有统计学意义（q=3.160和3.110，均P=0.000）。而当Vite的浓度≤125.0 μg/ml时，对实验组PAO1的生长无影响，差异无统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 Vite抑制PAO1生物膜的形成

图1 Vite对PAO1浮游菌生长的影响

当Vite的浓度为31.25 μg/ml，能使实验组PAO1生物膜的形成量从100%减少到（80.00±4.62）%，差异有统计学意义（t=4.428，P=0.002）。且随着Vite的浓度增高，其抑制生物膜的能力不断增强。当Vite的浓度上升至1 000 μg/ml时，几乎能完全抑制实验组PAO1生物膜的形成。而Vite的浓度≤125.0 μg/ml时，对实验组PAO1浮游菌的生长并无影响（见图1），因此，Vite抑制PAO1生物膜形成的作用并非完全由其抑制浮游菌生长所导致。见图2。

2.3 Vite与抗生素协同抑制PAO1生物膜的形成

图2 Vite对PAO1生物膜的抑制作用

CAZ、CIP、GEN和OFLX的MIC值分别为0.5、0.5、2.0和8.0 μg/ml。对照组、CAZ组、Vite组、CAZ+Vite组的生物膜总量分别为（100.0±0.0）%、（99.9±3.3）%、（82.0±3.2）%、（39.4±5.3）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=199.00，P=0.000）；对照组、CIP组[（97.4±4.3）%]、Vite组、CIP+Vite组[（40.3±3.1）%]比较，差异有统计学意义（F=237.4，P=0.000）；对照组、GEN 组 [（98.9±3.9）%]、Vite组、GEN+Vite组[（23.3±4.1）%]比较，差异有统计学意义（F=422.70，P=0.000）；对照组、OFLX 组 [（87.3±5.2）%]、Vite 组、OFLX+Vite组[（50.2±3.1）%]比较，差异有统计学意义（F=61.04，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，Vite组较对照组降低（P＜0.05）；各联合组较对照组和Vite组降低（P＜0.05）。见图3。

图3 Vite与抗生素联用对PAO1生物膜形成的影响

3 讨论

近年来，细菌生物膜的感染率不断增加，随着而来的高耐药率给临床诊疗带来极大的不便。传统的抗生素往往难以完全根除体内的生物膜，而传统抗生素与新型抗生物膜药物联合应用已成为目前研究的热点。本研究通过96孔板结合结晶紫染色法半定量分析，探讨Vite的抑制标准菌株PAO1生物膜的能力，并进一步探讨其与抗生素CAZ、GEN、CIP和OFLX的联合应用效果。本研究发现，当Vite浓度≥31.25μg/ml时能抑制PAO1生物膜的形成，且随着浓度增高，抑膜能力增强，有明显的剂量依赖性。且当Vite与抗生素联用时，有明显的协同抑制PAO1生物膜形成的作用。Vite是一种提取自牡荆属的多酚类化合物。有研究表明，Vite还具有抵抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的作用[7]。然而，其具体机制还未明确。多酚类化合物具有细菌群体密度感应（quorum sensing,QS）系统抑制剂的作用。QS系统是细菌间进行交流的信号系统，调控着生物膜的形成和分散。P.aeruginosa的QS主要包括2大系统，即：Las系统和Rhl系统。Las系统主要包括LasI/R双组份系统，Rhl系统主要包括LasI/R系统。细菌相互聚集时，自身能分泌一些信号分子，当这些信号分子浓度升高达到一定的阈值时，能与Las和Rhl系统的相应受体结合，通过信号传导，调控下游生物膜相关基因的表达或抑制，进而对生物膜的形成进行调控[8]。多酚类化合物可对QS系统进行干扰，抑制QS系统的正常调控功能[9]，从而抑制生物膜相关基因表达而抑制生物膜的形成。生物膜的形成主要还受到第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的调控。高浓度的c-di-GMP能促进细菌黏附因子的表达，从而促进菌体的附着与生物膜的形成。而低浓度的c-di-GMP可以增强菌体的运动能力及毒素的表达，而抑制生物膜的形成[10]。因此，Vite的作用机制有可能是通过抑制细菌体内c-di-GMP的形成而发挥作用。

不合理使用抗生素，常使体内残存亚抑菌浓度剂量的药物。这种亚抑菌浓度的抗生素长期存在时，不但不能有效杀灭细菌，反而还能促进细菌的突变和耐药性的增加。而生物膜的耐药性比相应的浮游菌要大，单一的抗生素使用往往难以根除生物膜。而Vite特有的抑制生物膜形成的作用使其与抗生素联用时有协同抑制生物膜形成的作用，从而可以一定程度上抑制亚抑菌浓度抗生素带来的副作用。

总而言之，Vite能抑制P.aeruginosa生物膜的形成，且当其与抗生素CIP、CAZ、GEN和OFLX联用使有协同作用。有望成为临床治疗细菌生物膜的一线用药。

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