聚乙二醇和聚丙烯酸钠对纳米碳酸钙口服制剂的改性评估研究*

廖明媚，王成志，肖平，赵劲风，潘一峰

（1.中南大学湘雅医院 卫生部纳米生物技术重点实验室，湖南 长沙 410008；2.中南大学湘雅医院 肾内科，湖南 长沙 410008）

慢性铅中毒一种职业病和流行病，现代城市化和工业化对环境的污染，使人们血铅水平普遍偏高[1]。铅能对人体神经、造血、消化、泌尿等系统造成不同程度的损害，能通过血脑屏障，铅超标严重影响儿童的智力发育[2]，使其学习和记忆能力下降。肠道是非职业性铅暴露时铅吸收的主要途径。铅入人体后，被吸收到血液循环中，主要贮积在骨组织中[3]，肝细胞对铅具有主动通透作用，可从血浆中摄取铅而排入胆汁，胆汁中的铅含量可达血中的40～100倍。目前西医传统驱铅方法是使用螯合剂如依地酸二钠钙等，但是其通过静脉给药特异性差，排铅同时非特异性地排泄内源性必需微量元素及维生素，干扰机体正常生理和生化功能，剂量大时对肾脏的重吸收功能有影响[4]。有研究表明[5]，碳酸钙的除铅效果随其粒径的减小而增强，纳米碳酸钙的除铅效果与口服除铅药物二巯基丁二酸的效果基本相同，且不增加肾脏负担[6]，但未改性的纳米碳酸钙具有很强的表面极性，表面能较高，较多纳米碳酸钙粒子聚集在一起形成团聚体[7]，影响其在有机体中的相容性和分散性，导致驱铅效果降低。本文利用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）和聚丙烯酸钠（polyacrylate sodium,PAAS）对球形纳米碳酸钙进行表面改性，以提高驱铅效率。可进一步制成口服制剂，直接定位十二指肠缓释置换排铅，阻断铅肠肝循环，不增加肾脏负担而完成除铅过程。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 纳米碳酸钙（山西芮城华新纳米材料有限公司），无水碳酸钠（天津市大茂化学试剂厂），无水氯化钙（天津市恒兴化学试剂制造有限公司），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA；国药集团化学试剂有限公司），十二水合磷酸氢二钠、PEG（国药集团化学试剂有限公司），PAAS（天津市光复精细化工研究所），水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器 电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），恒温磁力搅拌器（HI-3，金坛市医疗仪器厂），真空干燥箱（DZF型，北京市永光明医疗仪器有限公司），纳米粒度与电位分析仪（英国Malvern 仪器公司），超速冷冻离心机（德国Heraeus公司），超声波破碎仪（美国Fisher Scientific公司），Tecnai G2 Spirit TWIN透射电镜（美国FEI公司），S-3400N扫描电子显微镜（日本株式会社日立高新技术公司），D/MAX-3A型X射线衍射仪（日本理学公司），Nicolet 6700傅立叶红外光谱仪（美国Thermo Electron Scientific公司），AA320型原子吸收分光光度计（上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂）。

1.2 方法

1.2.1 微米碳酸钙制备 在2 mol/L Na2CO3溶液25 ml中搅拌下加入2 mol/L CaCl2溶液25 ml，充分反应30 min后，离心收集沉淀，双蒸水洗涤3次，无水乙醇洗涤3次，干燥后即可得到微米碳酸钙粉末。

1.2.2 改性纳米碳酸钙制备 在2 mol/L Na2CO3溶液25 ml中加入EDTA（2%，w/w-Na2CO3）和Na2HPO4（2%，w/w-Na2CO3），反应10 min；再将2 mol/L的含有PEG4000（1%，w/w-CaCl2）的CaCl2溶液25 ml缓慢滴加到上述Na2CO3混合溶液中，充分反应30 min后，加入PAAS溶液（1%，w/w-CaCl2）50 ml，间断超声10 min；室温静置72 h，离心收集沉淀，双蒸水洗涤3次，无水乙醇洗涤3次，干燥后即可得到改性纳米碳酸钙粉末。

1.2.3 配制模拟十二指肠液 取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 ml使溶解，用0.4%氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，另取胰酶10 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释成1 000 ml，即得模拟十二指肠液。

1.2.4 模拟肠液中铅离子浓度的测定 精密称量定量醋酸铅固体分别加入至100 ml模拟肠液中，使铅离子的终浓度为500 μg/L。精密称取纳米碳酸钙、改性纳米碳酸钙、微米碳酸钙各40 mg分别加入到上述含不同铅离子浓度的模拟肠液中，37℃恒温水浴，低速搅拌（100 r/min），按一定时间间隔，精密抽取2 ml溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液用原子吸收光谱仪测定铅离子浓度。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用重复测量设计的方差分析，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 制备的改性纳米碳酸钙的结构表征

所制备的改性纳米碳酸钙用粒径与电位分析、扫描电镜（scanning electron microscope,SEM）、透射电镜（transmission electron microscope,TEM）、X射线粉末衍射法（X-ray powder diffractometry,XRD）、红外光谱（infra-red,IR）分析等表征手段对其结构特征进行检测。粒径与电位分析显示制备的改性纳米碳酸钙平均粒径（91.28±10.2）nm，平均电位为（-28.8±6.43）mV（见图 1）。

扫描电镜和透射电镜显示改性纳米碳酸钙颗粒为单分散状态，颗粒形态为球形，颗粒分散均匀，不产生团聚效应（见图2）。利用红外光谱结合扫描电镜和XRD同时表征不同晶型的碳酸钙，根据未知物红外光谱中吸收峰的强度、位置和形状，推断该未知物的结构，鉴定不同的晶型。

图1 改性纳米碳酸钙电位检测结果

图2 改性纳米碳酸钙图 （×500 nm）

红外光谱出现的特征吸收峰为1 436.73、1 084.40、876.97及745.01 cm分别对应碳酸钙中C-O反对称伸缩振动、CO3的对称伸缩、CO32-面外变形振动和O-C-O的面内变形振动。其不仅在1 084.40、876.97出现方解石碳酸钙的特征吸收峰，还在745.01出现球霰石的特征吸收峰。见图3。

XRD显示制备的改性纳米碳酸钙混合物中有方解石（104）的衍射峰和球霰石（110）的衍射峰，说明PEG有利于加强球霰石碳酸钙的稳定性（见图4）。C-O反对称伸缩振动吸收峰出现在1 490.01和1 436.73 cm，而没有PAAS和PEG存在时生成的碳酸钙的在1 421 cm，相比较而言出现位移，且吸收峰变宽，这也是因为PAAS和PEG存在时碳酸钙晶体出现晶格畸变，而导致C-O反对称伸缩振动出现蓝移。PAAS和PEG对碳酸钙晶体的成核与生长有调控作用，两者更有利于球霰石碳酸钙粒子的稳定性。

2.2 3组碳酸钙在模拟十二指肠液中的除铅效果

在模拟十二指肠液中检测改性纳米碳酸钙、纳米碳酸钙和微米碳酸钙的除铅效果，处理1、2、3、4 h后的铅离子浓度比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间的除铅效果有差异（F=26.08，P=0.000）；②3组碳酸钙除铅效果有差异（F=11.16，P=0.028）；③变化趋势无差异（F=1.19，P=0.337）。见附表。

与微米碳酸钙比较，改性纳米碳酸钙粒径小，分散好，比表面积大，起效快，效果更明显，4 h能将铅离子浓度降至30 μg/L以下，除铅效果更优于未改性纳米碳酸钙（t=3.603，P=0.023）。见图5。

图3 改性纳米碳酸钙的红外光谱

附表 3组各时间的体外除铅效果比较 （μg/L，±s）

附表 3组各时间的体外除铅效果比较 （μg/L，±s）

组别 1 h 2 h 3 h 4 h改性纳米碳酸钙 282.6±12.5 115.0±10.0 63.3±7.5 21.0±4.0纳米碳酸钙 315.2±18.7 132.6±13.5 82.9±9.1 36.0±5.5微米碳酸钙 389.3±21.0 311.6±22.6 276.0±24.4 257.2±18.0

图4 改性纳米碳酸钙的XRD分析图

图5 3种碳酸钙除铅效果比较

3 讨论

碳酸钙价格低廉，来源广泛，主要用于工业填充剂、食品膨松剂、饲料强化剂等，由于碳酸钙是一种无毒且生物相容性良好的材料，因此在医药领域具有潜在的应用前景，如口服补钙剂、制酸剂及酸中毒时的解毒剂等。纳米级碳酸钙的制备主要采用机械粉碎法、化学反应沉淀法、碳化法制备，用于人体要求其pH固定，粒径均匀分散好，所用原料对人体无害。

碳酸钙属ABO3型晶体，因堆积方式不同，以方解石型、文石型、球霰石型和非晶态等多种形式存在。其中方解石是热力学上最稳定的晶型，在没有任何物质的影响的自然条件下，最终总是生成方解石晶型[8]。方解石晶体除了常见的菱形六面体外，在有机质存在下也能形成其他形态的方解石，有机质参与结晶过程进入碳酸钙的晶胞，导致晶格的缺陷和畸变[9]，同时有机质存在情况下可形成较为稳定的球霰石晶型[10]。EDTA和可溶性无机磷酸盐混合物可吸附在纳米粒子表面，提高纳米粒子的表面电荷，通过静电排斥提高粒子的分散性[11]，混合物作为晶形调节剂可得到表面积较大的纳米碳酸钙。分散剂——PEG具有极性，可吸附在纳米碳酸钙的特定晶面上，有利于球霰石晶型的形成与稳定[12]。PEG可在颗粒表面形成吸附层之间的位阻效应，增加其在人体内环境中的稳定性和缓释性，但是分子量过大可使降低位阻效应，增加浆液黏度。但是单用PEG所得的纳米碳酸钙电位绝对值小，随着放置时间延长易产生团聚。分散剂——PAAS可使纳米粒子的平均粒径减小，但是质量过大时反而造成纳米粒子分散稳定性降低[13]，PAAS在纳米碳酸钙颗粒表面形成定向排列的单分子层吸附，降低表面能，提高静电排斥，但是当界面吸附达到饱和，PAAS通过碳氢键的疏水作用缔合成胶团，使得黏度上升。在纳米碳酸钙中添加这2种分散剂，既具有静电稳定又具有空间位阻效应，增加电位绝对值，提高颗粒间的排斥力，使得纳米碳酸钙的分散性更好、稳定性更强。为控制粒子粒径与纳米碳酸钙的粉体比例，选用PEG和PAAS的质量为氯化钙质量的1%，可以得到良好分散效果而不形成胶团。

本文制备的改性纳米碳酸钙在模拟肠液中4 h左右能将铅离子浓度降低至30 μg/L以下，与普通纳米碳酸钙驱铅速率基本相同，也与徐幸民[5]、刘雨涛[6]等报道的非改性纳米碳酸钙驱铅速率基本相同。由于纳米碳酸钙长时间放置容易沉淀、形成团聚体，影响其驱铅效率，将纳米碳酸钙经过改性之后，提高其稳定性，从而提高驱铅效率。本文制备的改性纳米碳酸钙是在晶型调节剂和PAAS、PEG 2种分散剂存在下，由碳酸钠与氯化钙均质搅拌，发生化学沉淀反应制成，得到大小适宜、分散均匀、电位适中的球形纳米粒。改性纳米碳酸钙粒径大小合适，分布窄，不含有毒物质和碱性物质，适用于制成人体肠道除铅的药剂，定位十二指肠缓释置换铅离子，形成不被肠道分解和吸收的碳酸铅，随粪便排出体外，所置换出的钙离子既能起到机体补钙的需要，还可阻止铅在肠道内的滞留与吸收。

综上所述，经PEG和PAAS改性后的纳米碳酸钙性质稳定，无毒，可进一步制成口服制剂应用于人体肠道除铅。

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