拟南芥生物钟突变体gi延迟营养生长时相转变

郭 蕊，傅 钰，马婉琪，王 苓，白 惠，龙 鸿

(天津农学院 园艺园林学院，天津 300384)

营养生长是高等植物早期形态建成的重要时期，由幼龄期和成熟期组成[1]。只有经历幼龄期和成熟期，实现营养生长时相转变(vegetative phase change, VPC)，植物体才能进入生殖生长，完成开花、结果[2]。

最早关于VPC的研究是Knight对木本植物梨树(Pyruscommunis)和苹果(Malusdomestica)进行的嫁接实验，实验说明了植物的营养特性与其未来生殖能力密切相关[3]。

模式植物拟南芥中，幼龄期叶片近圆形，叶缘平滑，叶片长宽比小，仅在近轴面出现表皮毛；成熟期叶片近匙形，叶缘卷曲，近轴面和远轴面均具有表皮毛[2-3]。调控VPC的分子基础仍不清楚，拟南芥和玉米(Zeamays)中VPC的分子遗传分析表明，一种小分子RNA，miR156，及其靶基因SPL(SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEINLIKE)基因家族，在这个转变中发挥重要作用。miR156表达量在幼龄期较高，而在成熟期则降低；SPL3基因表达则相反，并受到miR156的强烈抑制[2,4]。

生物体中，以约24 h为一个时间节点，周期反复振荡，这一节律，接近地球自转周期，在原核和真核生物中都存在，是为生物钟[5-6]。研究表明，生物钟参与调控植物生理和生长发育过程，如细胞伸长、气孔开闭、叶片运动和开花等[5]。生物钟由输入途径、输出途径及核心振荡器组成；生物钟核心振荡器又由中心反馈环、早反馈环及晚反馈环组成[7-8]。拟南芥中，该反馈调节环由3个基因组成:CCA1 (CIRCADIANCLOCKASSOCIATED1)、LHY(LATEELONGATEDHYPOCOTYL)和TOC1 (TIMINGOFCABEXPRESSION1)，其中LHY和CCA1负调控TOC1表达，TOC1则正向调控LHY和CCA1表达[9]。GI(GIGANTEA)是植物特异的核蛋白，GI在开花时间调控、光信号传导、下胚轴伸长、生物钟调控、糖和淀粉积累、抗植物逆境胁迫等许多生理反应中起作用[10]。在参与生物钟调控中，GI是维持CCA1和LHY启动子高表达所必需，并可能是一个TOC1的共同作用因子[5]。

营养生长时相转变是植物生长发育的一个重要生理过程，与植物自身生物钟节律密切相关，但其调控机制仍不清楚，生物钟相关基因在此转变中的作用仍不明确。本研究对拟南芥gi突变体VPC过程进行了观察研究，以探讨GI对VPC的影响，为生物节律与VPC之间的关联提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

材料来源参见文献[11]。WT-Col背景下的gi突变体在突变体库中编号为SALK_092757。

1.2 方法

1.2.1 植物种植

方法参见文献[11]。植物生长箱中培养周期为：光照培养16 h，暗培养8 h。

1.2.2 植株形态观察

待种子长出子叶后，开始观察野生型Col-0及突变体gi的表型，并记录其生长速率。方法参见文献[11]。抽薹后，将所有莲座叶片摘下，测量其长和宽，计算其长宽比。

1.2.3 石蜡切片

方法参见文献[11]。

1.2.4 反转录PCR(RT-PCR)与荧光定量PCR(Q-PCR)

利用RT-PCR与Q-PCR做miR156表达分析，为Actin-2。植株的总RNA采用CTAB法提取，反转录方法参见文献[11]。miR156扩增采用颈环法，Col-0扩增33个循环，gi扩增31个循环。Q-PCR实验过程中使用BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪，反应条件参见文献[11]。引物序列：Actin2-F:5′-GCTGAGAGATTCAGATGCCCA-3′，Actin2-R:5′-GTGGATTCCAGCAGCTTCCATACT-3′；miR156-F:5′-CATCTTGTAGATCTCTGAAGTTGGACT-3′，miR156-R: 5′-GAGATTGAGACATAGAGAACGAAGACA-3′。

2 结果与分析

2.1 gi突变体莲座叶远轴面表皮毛出现和生长发育进程

为探讨GI对植物生长发育过程和VPC的影响，我们观测了gi突变体的生长周期特征。通过对各自25株植株进行详细的表型观察统计及分析可看出，野生型Col-0莲座叶叶片总数为10片，gi突变体莲座叶叶片总数为40片，数量明显增多(表1)，说明突变体gi生长周期明显延长；Col-0莲座叶出现远轴面表皮毛为第6片(15 d时)，而gi则是在第8片(18 d时)，表明突变体的远轴面表皮毛出现晚于野生型(表1;图1)，说明其VPC被延迟；生长发育进程观察显示，野生型Col-0在生长约23 d出现可见花芽，而突变体在约43 d才出现可见花芽(表1)，开花明显延迟。

表1 拟南芥野生型和突变体营养生长发育情况统计Table 1 Growth characteristics of wild-type Col-0 and mutant gi

2.2 gi突变体的叶形和叶片长宽比

为进一步探讨gi突变体的VPC过程特点，我们对野生型Col-0和gi突变体的叶形变化进行了观察比较。结果显示，野生型Col-0的前4片莲座叶接近圆形，后期的叶片则呈渐长的匙形，叶片长宽比在第6片叶时达到高位值1.55，随后逐渐增大；gi突变体的前5片莲座叶也近圆形，后期的叶片逐渐呈较长的匙形，叶片长宽比在第8片叶时达到高位值1.89，随后逐渐增大(图1)，说明野生型和突变体分别在第6和第8片叶时完成VPC，与远轴面表皮毛出现的时间一致，突变体的VPC被延迟。

图1 野生型Col-0与gi突变体的叶形图及不同生长时期gi突变体和野生型的叶片长宽比Fig 1 Leaf morphology of wild-type Col-0 and gi mutant and the length width ratio of leaves in wild-type Col-0 and mutant giA：Col-0从第1片真叶开始至第11片莲座叶叶形；B：gi从第1片真叶至第39片莲座叶叶形。箭头处表示VPC发生时期，即从箭头后的叶片开始出现远轴面表皮毛，Bars=1 cm。C：叶片长宽比是以叶片顶端到叶柄联合处的距离为长，叶片中部最宽位置为宽得到的比值。* P<0.05 (Student′s t-test)

2.3 gi突变体的茎尖分生组织解剖结构特征

我们在解剖结构层面对茎尖分生组织(shoot apical meristem, SAM)的发育过程进行了显微观察。茎尖石蜡切片结果显示：Col-0在生长第5 天时，植株分化出2片叶，此时SAM生长锥纵切面呈平坦状，细胞尚未分化(图2-A)；在生长第10天时，植株分化出4片叶，生长锥纵切面稍有凸起，SAM的原套细胞为单层(图2-B)；在生长第15天时，植株分化出6片叶，生长锥明显凸起，原套细胞开始分化成多层，原体和髓分生组织细胞分裂，数目增多(图2-C)；在第19天，植株分化出8片叶，生长锥继续生长、发育，凸起增高(图2-D)；在第23天时，植株分化出12片叶，花原基出现(图2-E)。gi突变体在生长第5天时，植株分化出2片叶，SAM纵切面也为平坦状，细胞无分化(图2-F)。在生长第10天和第15天时，植株分别分化出4片叶和6片叶，生长锥纵切面开始凸起，但茎尖分生组织原套细胞无分化或为单层(图2-G和2-H)；在生长第19天时，植株分化出8片叶，生长锥纵切面凸起明显，原套、原体和髓分生组织均分化、发育(图2-I)；在生长第43天时，植株分化出20片叶，花芽发育(图2-J)。根据野生型和突变体茎尖生长锥明显凸起且分化的时间(分别为第15天和第19天)，判定突变体VPC延迟，与形态学观察结果一致。

2.4 miR156表达量水平显示GI突变导致VPC推迟

我们还检测了植株发育过程中miR156的表达变化。RT-PCR显示，在野生型Col-0和突变体gi植株中miR156的转录水平都随着生长进程呈下降趋势。Col-0植株在第15 d时，miR156表达量比第11天明显降低，只约为前者的一半(图3)，说明在15天时发生VPC；突变体植株则是在第19天时表达量约为15天时的一半(图3)，说明在19 d时发生VPC。这一结果表明，突变体VPC延迟。随后发育中，当植株进入开花期(即Col-0生长到23 d，gi生长到43 d)时，几乎检测不到miR156的表达(图3)。

图2 野生型Col-0与gi突变体茎尖分生组织解剖结构Fig 2 The anatomical structure of SAM of wild type Col-0 and mutant gi

A-E：Col-0在LD下生长5、10、15、19、23 d时SAM纵切图；F～J：gi在LD下生长5、10、15、19和43 d时SAM纵切图。A～J：Bars=50 μm。左上角为切片取材时植株的生长发育情况，Bars=1 cm

图3 RT-PCR检测Col-0与gi不同发育过程中miR156的表达Fig 3 Expression analysis of miR156 in Col-0 and gi with RT-PCR amplification

A：Col-0植株中在LD下生长11、15、19、23 d时miR156的表达量变化; B：gi植株中在LD下生长11、15、19、23、27、31、35、39和43 d时miR156的表达量变化；Actin-2基因为内参，其表达量作为对照

进一步荧光定量PCR检测结果显示，随着生长发育进程，野生型和突变体植株中的miR156表达均呈下降趋势，且miR156在gi中的表达量高于相应发育时期的Col-0(图 4)；Col-0植株在生长第15天时，miR156的表达量下降最快，比前面11 d时测定的量下降1倍多，而gi突变体植株则在第19天时miR156的表达量下降到前面的1倍多，之后均缓慢下降，说明野生型和突变体植株分别在第15天和第19天时发生VPC，gi突变体中相对于野生型Col-0延迟了VPC，与本文中其他实验(包括RT-PCR检测)结果相符。

3 讨论

在对长日照开花途径的研究过程中，鉴定出了与开花相关的重要基因CO(CONSTANS)、FT(FLOWERINGLOCUST)和GI(GIGANTEA)[12]。其中GI是一个与生物钟相关的控制开花周期的基因，GI发生突变导致拟南芥在长日照条件下开花延迟[13]，GI超表达会造成早花表型[14]。由于开花是营养生长的延续，GI作为生物钟相关基因，参与调节了开花的进程，但它对营养生长发育进程的影响仍未知。

图 4 Col-0与gi不同发育过程中Q-PCR检测miR156表达Fig 4 Relative expression analysis of miR156 in Col-0 and gi with Q-PCR amplification

Col-o植株在生长第15 d时，miR156的表达量比gi植株在生长第19 d时下降较快，结果表明，突变体相对于野生型Col-o延迟了VPC。*P<0.05 (Student′st-test); **P<0.01

本文中，我们从观察突变体gi的生长发育进程起始，对其VPC进行了较为详细的研究。结果显示，从形态特点、解剖结构以及调控VPC的miR156表达的分子检测等各方面分析，对比野生型Col-0，gi突变体的VPC延迟；而且，gi突变体全部生长发育历时较长，至第43天才出现可见花芽，果实成熟需要80 d以上，而野生型Col-0在生长约23 d即出现可见花芽，约60 d果实即成熟，说明gi突变体营养生长时期中成熟期被延长，植株进行较长时间的营养生长，产生更多的叶片，导致迟迟不开花，结果期也延长。据此推测，GI可能参与VPC的调控，使得植株从幼龄期及时转变到成熟期，同时，通过和其他开花基因互作，及时完成从营养生长到生殖生长的转变，调控植物正常开花；GI基因突变，导致VPC延迟的同时，也产生晚花、晚结果的表型。此外，我们的前期研究[11]表明，莲座叶数目减少的突变体mgo3推迟了VPC的发生；而莲座叶数目增多突变体amp1-1并未使VPC的发生提前，切除第1、2片真叶推迟了Col-0的VPC发生。本研究中，gi突变体莲座叶叶片总数明显增多，但其VPC延迟；推测突变体幼龄期产生的真叶受GI基因突变影响较大，数量较少，造成VPC发生延迟，而在VPC完成后的成熟期，突变体产生了较多的叶片，使得其成熟期被延长。Yang等[15]通过叶原基切除实验证明，VPC起始于叶原基的信号，这些信号抑制了miR156的转录而起作用，这种叶原基产生的因子可能与植物叶片数量相关。从本研究的结果分析，这种相关性可能更集中在幼龄期叶片的发生上，且也是通过miR156的表达调控的。

SAM的解剖结构在拟南芥发育成熟过程中产生了凸起的变化[11,16]。gi突变体营养生长期间SAM解剖观察表明，突变体茎尖分生组织原套、原体细胞和髓分生组织的高度均低于野生型，且分裂的细胞层数和分化状态发生变化，说明GI活性缺失改变了生长的节律，延迟了SAM的发育，原套产生多层细胞较晚，原体和髓分生组织的细胞发育延迟，使得突变体莲座叶生长速率落后于野生型。GI可能通过调控SAM细胞活性使其发育延缓，从而造成营养生长时相转变的延迟。我们在前期工作[11]的基础上，通过本研究进一步说明VPC的发生与茎尖分生组织中原套、原体细胞和髓分生组织的细胞分化相关，进一步的工作有待GI的时空表达原位杂交定位。

4 小结

我们的研究结果表明GI除了参与开花调控外，也在VPC调控中起作用，因此，GI具有功能冗余作用，这些结果也暗示了营养生长和生殖生长可能存在的发育相关性，其他生物钟基因是否也具有此特性尚待研究。

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