人甲状腺乳头状癌中前列腺素E2受体及其下游信号分子的表达及意义

胡芳 阔依旦·图亚 韦晓虹 刘雪婷 罗顺葵 孙辽中山大学附属第五医院内分泌与代谢病科（广东珠海 59000）；新疆自治区人民医院（乌鲁木齐80000）；深圳市第二人民医院（广东深圳58000）

甲状腺乳头状癌（papillarythyroid carcinoma，PTC）是我国增长速度最快的恶性肿瘤之一［1-2］。目前有关前列腺素受体及其下游信号分子在肿瘤发生发展中的研究得到医学领域的关注［3］。笔者前期研究发现：COX⁃2在人PTC组织中表达明显增加，其主要产物PGE2的合成也明显增加［4］，PGE2主要通过其EP受体发挥生物学作用。但目前EP受体在PTC中的表达鲜有报道。本研究通过分析癌旁正常甲状腺组织（adjacent normal tissues，ANT），结节性甲状腺组织（nodular goiter，NG），PTC组织EP受体及其下游信号分子的表达，初步探讨PGE2/EPs在PTC发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 病例及标本 留取2013年8月至2014年2月中山大学附属第五医院普外科甲状腺结节全切或次全切除术后的新鲜甲状腺组织。从中选取经病理结果确认的甲状腺乳头状癌组织15例（PTC）及其癌旁甲状腺组织（ANT），结节性甲状腺肿组织15例（NG），用于RT⁃qPCR检测，全部病例术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。同时收集患者术后的石蜡标本，切片厚度为5 μm，用于免疫组化。本实验研究经过中山大学附属第五医院医学伦理委员会同意审批。

1.2 主要试剂 RT⁃qPCR引物设计和合成（Invit⁃rogen，USA）；TRIzol RNA 提取试剂（Invitrogen，USA）；PrimeScript RT Reagent Kit Perfect Real Time试剂盒（TaKaRa，日本）；EP4受体多克隆抗体（Cayman，USA）；兔多克隆抗体 PKAα+β及Epac1（Abcam，USA）：兔多克隆抗体 Phospho⁃AMPKα（Cell Signaling，USA）。即用型高效免疫组化二抗试剂盒（Thermo Scientific，USA）。

1.3 RT⁃qPCR 新鲜甲状腺组织使用Trizol研磨，提取总RNA，逆转录为cDNA，引物序列见［4］。使用下列扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共循环40次，95℃反应5 s，65℃反应1 min。使用β⁃actin作为内参。每个样本分别作3次重复，使用2-ΔΔCt公式进行数据计算。

1.4 免疫组化 组织玻片经脱蜡水化，EDTA（pH=8.0）溶液微波炉高温修复，3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，孵一抗4℃过夜，二抗孵育后DAB显色3 min，苏木素染核，PBS返蓝，以结肠癌组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。利用Zeiss正置荧光显微镜观察结果并用其彩色CCD数码相机拍照，每张切片随机选取5个区域进行拍摄，放大倍数选200×，所有照片均在同一条件下一次性拍摄完成；染色强度计算：用image⁃pro plus 6.0软件对每张免疫组化照片进行平均光密度计算，阳性表达越强则光密度数值越高。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计分析，当数据符合正态分布时用“均数±标准差”表示，并采用方差分析和t检验，当数据为非正态分布时用“中位数（四分位间距）”表示，采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC患者临床资料 甲状腺乳头状癌PTC组男2例，女13例，平均（36.17±13.09）岁。结节性甲状腺肿NG组男3例，女13例，平均（41.63±13.99）岁。两组性别构成及年龄均无统计学差异。

2.2 EP4mRNA在甲状腺乳头状癌组织表达上调 EP1和EP3的mRNA表达在3组间无统计学差异（P=0.276，P=0.655）。与ANT相比，PTC及NG组EP2的mRNA表达明显增加（P=0.001，P=0.000），但EP2的mRNA表达在PTC及NG组间无统计学差异（P=0.211）。EP4的mRNA表达在PTC组中的表达较ANT和NG组均高，差异有统计学意义（P=0.015，P=0.035），而在ANT组和NG组间的表达无统计学差异（P=0.549）。见图1。

图1 ANT，NG及PTC甲状腺组织中EPs的表达Fig.1 mRNA expression of EPs in thyroid glands of ANT，NG and PTC

2.3 EP4及其下游因子PKA、Epac和AMPK在甲状腺乳头状癌组织中表达上调 EP4受体及AMPK蛋白在细胞质与细胞核均有表达，PTC组中表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。PKA及Epac主要在细胞质表达，PTC组中表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 EP4，PKA，Epac和AMPK在甲状腺乳头状癌组织中的免疫组化结果Fig.2 Immunohistochemical resultsof EP4，PKA，Epac and AMPK in thyroid papillary carcinoma

3 讨论

本研究结果显示4种EP受体在甲状腺组织中均有表达，但EP4 mRNA在PTC中表达率最高，这一结果提示EP4是与PTC发生、发展关系最密切的EP受体。EP4受体主要通过结合Gs促进cAMP生成，从而发挥其生物学作用［5］。cAMP作为细胞内广泛存在的第二信使，通过其下游主要信号分子PKA、Epac以及AMPK介导的信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡等病理生理过程［6］。

笔者研究发现PKA蛋白在PTC中表达明显高于ANT及NG组织。PKA是一种cAMP依赖的蛋白激酶，主要介导G蛋白偶联受体的信号转导。PKA分为4型：RIa，RIβ，RIIa，and RIIβ［7］。不同亚型在细胞增殖、分化中表达存在差异［8］。FERRERO等［9］发现PKARIIβ在分化型甲状腺癌及未分化型甲状腺癌中表达明显高于ANT组织，PKARIa蛋白仅在未分化型甲状腺癌中表达。我们研究检测的是PKA（α+β），关于各个亚型在甲状腺乳头状癌中表达的情况如何，以及具体通过哪种亚型介导其作用，有待进一步深入研究。

笔者的研究结果显示Epac1蛋白在PTC中表达明显高于NG及ANT组织。甲状腺组织中主要表达Epac1，且不同类型甲状腺肿瘤细胞中Epac1表达存在差异［10］。BROECKER等［10］发现：相比滤泡状PTC，典型和高柱状PTC中Epac1呈中等表达；而与良性甲状腺腺瘤对比，Epac1在PTC相对低表达。在MISRA等［11］的研究中发现Epac1可以诱导前列腺癌的细胞增殖，而这一过程是由B⁃Raf/ERK及mTOR信号通路所介导。在关于小鼠肺上黑色素瘤移植瘤的实验中，发现Epac通过硫酸肝素相关机制来促进肿瘤细胞迁移［12］。而在PTC中，Epac通过哪些信号途径参与其发生、发展过程尚未清楚，有待进一步研究。

笔者研究结果显示：AMPK蛋白在PTC中表达明显高于NG及ANT组织。同样VIDAL等［13］人发现AMPK在PTC中是高表达的，AMPK在PTC及ANT中主要是在细胞质中染色，在细胞核及细胞膜中也有部分表达。这与笔者的研究结果一致。肿瘤细胞在不断增殖分化过程是需要消耗大量ATP，AMPK主要调控细胞内的代谢及能量守恒［14］。关于AMPK的研究发现，AMPK的激活可以抑制肺癌、乳腺癌和卵巢癌细胞增殖［15-16］。而AMPK抑制肿瘤作用主要通过上游肿瘤抑制酶LKB1激活和磷酸化AMPK继而抑制下游mTOR来抑制肿瘤［17］，mTOR与BRAFV600E基因突变有关。而在黑色素瘤的研究中发现，BRAFV600E基因突变导致LKB1/AMPK解偶联，进而改变与其相关的mTOR通路［18］。这一研究解释了甲状腺乳头状癌AMPK高表达可能，但仍需要进一步研究。

综上所述，本研究发现EP4及其下游主要信号分子PKA、Epac和AMPK在PTC中表达增加，但具体机制仍需要进一步研究，为EP4应用于甲状腺乳头状癌的临床诊断及治疗提供理论依据。

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