去甲乌药碱对2型心肾综合征大鼠心肾的保护作用

韦震鸣 傅强 李志樑 吴英智 王慧敏

南方医科大学珠江医院心血管内科（广州510280）

2型心肾综合征以慢性心衰合并慢性肾功能不全为特征［1］，血流动力学的紊乱、神经激素机制的激活及尿毒症毒素的聚积，诱发心肌纤维化及左室重塑，最终心肾共同衰竭，因此改善血流动力学、抑制纤维化是2型CRS防治的关键点［2］。然而，临床上尚无有效的治疗手段，患者病死率较高，需构建实验室动物模型来模拟人类2型CRS的临床病理生理状态，为药物治疗的研究提供基础。去甲乌药碱是附子的活性成分，作为β受体部分激活剂，可在一定程度上改善心衰状态。此外，还能扩张外周血管，增加冠状动脉血流，减轻缺血再灌注损伤［3-4］，具有潜在的抗心肌纤维化作用，目前国内外尚未有关于去甲乌药碱抑制心肌纤维化研究的文献报道。因此，本实验采用冠动脉左前降支结扎术（CAL）联合右肾摘除、左肾动脉分支结扎的 5/6肾次全切除术（STNx）［5］构建 2型心肾综合征大鼠模型，诱导心肌纤维化，并通过腹腔注射不同剂量的去甲乌药碱，观察心功能和组织学变化，探讨去甲乌药碱能否通过抑制心肌纤维化、减轻左室重构，从而改善肾功能，阻断心肾交互，发挥心肾同步保护的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠80只，体质量200～250 g［许可证号SCXK（粵）2011-0015，南方医科大学实验动物中心］，独立通气笼中适应24 h后进行手术。

1.2 药物 去甲乌药碱盐酸盐（上海远慕生物科技有限公司，批号JOT⁃10761，纯度98%）。肌酐、尿素氮、尿蛋白定量试剂盒（知行生物科技有限公司）、大鼠血硫酸吲哚酚ELESA试剂盒（上海优选生物科技有限公司）。

1.3 模型制备及分组 72只SD大鼠5%水合氯醛腹腔注射麻醉，直视下气管插管，呼吸机（泰盟HX⁃100E）辅助呼吸，分离左侧胸部皮肤和肌肉，沿胸骨左缘3～4肋间切开，暴露心脏，行左前降支冠状动脉结扎术，诱发心梗。1周后，行右肾摘除联合左肾动脉前上支、前下支及背支结扎的5/6肾次全切除术，诱发肾功能不全。另外8只大鼠以同样的时间点，仅行心包膜及肾包膜撕开的假手术，不结扎。将造模成功的54只大鼠随机分成模型组（CRS，n=12）、低剂量组（LD，n=13，0.5 mg/kg）、中剂量组（MD，n=13，1.5 mg/kg）、高剂量组（HD，n=16，4.5 mg/kg）。

1.4 药物配制及给药 肾次全切除术后1周开始给药，去甲乌药碱用生理盐水分别配制成0.45%、0.15%、0.05%的溶液，按0.1 mL/kg腹腔注射1次/d，共2周，模型组腹腔注射等量生理盐水。

1.5 标本收集及指标观察

1.5.1 超声心功能分析 给药2周后异氟烷吸入麻醉下，超声仪（Vevo 2100 Imaging System）行超声检查。

1.5.2 生化指标检测 称量体质量，麻醉后心尖取血法收集血液标本，离心取血清。代谢笼收集大鼠尿液，记录24 h尿量，尿液离心后，取上清液。试剂盒检测血肌酐、血尿素氮、血硫酸吲哚酚、尿肌酐、尿蛋白等。

1.5.3 组织收集及切片染色 取血后取出心脏和肾脏，称量心脏、左心室和肾脏质量，并于4%甲醛中固定、脱水、包埋、切片，按标准步骤进行染色，Image Pro Plus 6.0软件分析胶原染色面积和荧光强度。

1.6 统计学方法 所有资料数据均采用SPSS 22.0的one⁃way ANOVA程序进行多组间对比统计分析，计量资料均以±s表示，组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett-T3检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脏超声结果 相比假术组，模型组大鼠生存率、EF、FS均显著降低（P＜0.01），收缩期内径增加约2倍、前壁变薄，Hw/W、LVw/W、LKw/W均显著增高（P＜0.01）。低、中、高剂量组生存率、EF、FS均有明显改善趋势（P＜0.01），收缩期前壁厚度增加63%，Hw/W、LVw/W、LKw/W均有逐渐降低趋势（表1）。

表1 各组大鼠心脏超声指标比较Tab.1 Comparison of echocardiogram parameters of different groups ±s

表1 各组大鼠心脏超声指标比较Tab.1 Comparison of echocardiogram parameters of different groups ±s

注：EF，射血分数；FS，左室短轴缩短率；LVIDs，左室收缩期内径；LVAWs，左室收缩期前壁厚度；Hw/W，心脏质量/体质量比；LVw/W，左室质量/体重比；LKw/W，左肾质量/体质量比；与假术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 例数EF（%）FS（%）LVIDs（mm）LVAWs（mm）Hw/W（mg/g）LVw/W（mg/g）LKw/W（mg/g） 生存率（%）假术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组8 7 9 9 1 3 77.43±1.89 30.96±2.38**43.09±2.15*45.39±1.99*53.48±2.12**47.55±1.81 16.94±1.29**23.16±1.43*23.86±1.15*28.03±1.04**3.63±0.20 7.26±0.10**6.78±0.18 6.49±0.18*5.69±0.20**2.58±0.08 1.31±0.07**1.38±0.11 1.53±0.08*2.13±0.12**2.76±0.07 5.07±0.17**4.41±0.10*4.62±0.17*4.01±0.19**1.80±0.08 3.46±0.20**2.56±0.18*2.59±0.17*2.30±0.10**2.94±0.05 5.56±0.18**4.93±0.15*4.50±0.22*4.02±0.18**100.00 58.33 69.23 69.23 81.25

2.2 肾功能指标 相比假术组，模型组Bcr、BUN、24 h Upro、IS明显升高（P＜0.01），Ucr、24 h Ccr明显降低（P＜0.01）。低、中、高剂量组Bcr、BUN、24 h Upro、IS水平有逐渐降低趋势，Ucr、24 h Ccr明显升高（P＜0.01），肾功能呈好转趋势（表2）。

2.3 心肌MASSON染色分析 相比假术组，模型组心肌胶原面积（蓝色部分）明显增大（P＜0.01），结构紊乱、维断裂、间隙增宽，连续性差。低、中、高剂量组胶原面积比例逐渐下降（P＜0.01），结构逐渐整齐，连续性变好（图1）。

2.4 心肌免疫荧光染色 相比假术组，模型组CollagenⅠ和TGF⁃β荧光强度明显增高（P＜0.01），可见明显大块状荧光染色区域。低、中、高剂量组CollagenⅠ和TGF⁃β荧光强度呈逐渐减弱趋势（P＜0.01），荧光由块状逐渐变成散在点状（图2、3）。

3 讨论

动物模型的构建是目前心肾综合征研究的难点和关键手段，而国内外可用的2型CRS大鼠模型非常少。因此，本实验尝试采用冠动脉左前降支结扎术联合右肾摘除、左肾动脉分支结扎的5/6肾次全切除术构建2型心肾综合征大鼠模型，成功诱导了心肌纤维化，缩短了造模周期，在造成慢性心肾功能损伤的基础上保持了器官的完整性。超声和生化指标结果显示模型组心肾功能均显著降低，心肌纤维化面积增大，纤维因子Collagen I和TGF⁃β表达显著增高。符合2型CRS病理生理状态，是较为理想的研究2型CRS的动物模型。

表2 各组大鼠生化指标与体质量比Tab.2 Comparison of biochemical indicator of different groups ±s

表2 各组大鼠生化指标与体质量比Tab.2 Comparison of biochemical indicator of different groups ±s

注：与假术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 例数 体质量（g）Bcr（μmol/L）Ucr（μmol/L）24 h Ccr（mL/d）BUN（mmol/L）24 h Upro（mg/d）IS（pg/mL）假术组模型组低剂量组中剂量组高剂量组8 7 9 9 1 3 296±7.96 307±17.46**280±6.15*279.7±11.71 286±13.08 23.33±0.95 74.90±6.44**73.56±6.35*63.32±2.66**62.35±3.14**253.12±39.54 18.06±2.30**30.02±5.74*33.20±4.58*82.94±24.23**0.282±0.072 0.029±0.013**0.033±0.008 0.039±0.009*0.067±0.03**3.65±0.23 12.64±1.54**9.04±0.76*7.78±0.43**5.27±0.36**7.28±0.99 17.49±1.92**10.60±0.64*9.52±1.67**8.64±0.79**102.06±12.39 151.02±7.81**136.65±1.59 133.05±10.52*131.91±6.33*

图1 各组大鼠心肌MASSON染色（×200）Fig.1 Heart tissue with Masson staining of different groups（× 200）

图2 各组大鼠心肌CollagenⅠ免疫荧光结果（×400）Fig.2 Immunofluorescence staining of CollagenⅠin heart tissue of different groups（× 400）

图3 各组大鼠心肌TGF⁃β免疫荧光结果（×400）Fig.3 Immunofluorescence staining of TGF⁃β in heart tissue of different groups（× 400）

血流动力学是2型心肾综合征发病的始动因素［6］，慢性心衰导致的血流动力学紊乱在诱发慢性肾功能不全的同时，可激活神经激素机制、促进肾素的释放，诱发心肌纤维化，加重心室重构，最终心肾共同衰竭。因此，抑制心肌纤维化、改善心肌收缩力，从而改善血流动力学状态，是控制心衰和慢性肾病发展的重要手段［7］。

本研究显示，随着去甲乌药碱剂量增高，在心功能提高的同时，肾功能逐渐得到改善，体现出呈剂量依赖性的心肾保护作用。EF%显著升高，Hw/W、LVw/W、LKw/W均明显降低，血肌酐明显下降、尿肌酐排出明显增多、滤过率明显改善，尿蛋白、血尿素氮、显著降低。心肌纤维化面积逐渐减少，纤维化因子CollagenⅠ和TGF⁃β表达逐渐降低，说明去甲乌药碱抑制心肌纤维化作用可能是通过抑制纤维化通路TGF⁃β/smads或者纤维化旁路ERK1/2实现，需进一步研究探寻其具体机制。

近年来有研究表明，硫酸吲哚酚（IS）可能与2型心肾综合征大鼠心肾纤维化相关［8-9］。作为蛋白质结合的尿毒症毒素之一，IS无法通过透析除去［10］，在体内蓄积易诱发心肌纤维化，还可激活免疫细胞诱发冠动脉斑块形成［11］，增加心血管事件发生的风险。研究结果显示模型大鼠血清IS水平显著升高，心肾功能损伤效果明确。去甲乌药碱低、中、高剂量组血清IS水平呈逐渐降低趋势，说明去甲乌药碱有潜在的促IS排泄的作用，可能与血流动力学改善、肾功能好转有关，但具体机制仍需进一步研究。

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