干扰素β和γ基因修饰的人羊水间充质干细胞的制备

刘安琪 杜晶春 蓝晓 陈柳池 徐霞

广州医科大学金域检验学院（广州510182）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是能够从多种组织来源的基质细胞分离出来的一种具有分化潜能的干细胞，在骨髓中最先被发现，现在还可从脐带、外周血、脂肪组织、骨骼肌、羊水等［1］组织中分离获得。能够分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞等多种组织细胞。羊水来源的间充质干细胞具有发育阶段原始、易于获得、不涉及伦理问题等优点。

干扰素（interferon，IFN）是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的，是一类具有广泛生物活性的细胞因子，具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。可是干扰素在体内半衰期很短，全身给药达到治疗效果的干扰素剂量对机体器官的毒性相当大，因此限制了干扰素的广泛应用。

MSCs易于体外扩增培养，具有天然免疫豁免特性以及向肿瘤细胞迁移的能力［2］，且易于被逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等载体转染。有文献报道，慢病毒载体更适用于干细胞，其对分裂和非分裂细胞都具有感染能力［3］。因此，本实验考虑用hIFN⁃β、hIFN⁃γ修饰人羊水间充质干细胞（human amniotic fluid derived mesenchymal stem cells，AFM⁃SCs），并成功实现其表达和分泌，从而为探索肿瘤的靶向基因治疗提供合适的细胞载体。

1 材料与方法

1.1 细胞 人羊水来源间充质干细胞：在广州医科大学附属第一医院临床产前诊断正常标本中收集羊水组织培养获得。293FT细胞：购于中国科学院细胞库。

1.2 试剂和仪器 试剂：低糖DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液、0.25%胰酶-0.2%EDTA均购自美国Gibco公司，Recombinant Human FGF⁃basic购自 PeproTech 公司，BIO⁃AMFTM⁃2 培养基购自以色列Biological Industries公司，Lipo⁃fectamine2000、opti⁃MEM 培养基购自美国 Invitro⁃gen，携带hIFN⁃β、hIFN⁃γ、EGFP基因的质粒购于广州复能生物公司，Human Interferon Beta ELISA kit、Human IFN gamma ELISA kit购自Arigo公司，Cell Counting Kit 8购自日本同仁公司，流式分析用抗体购自BD公司。仪器：倒置相差显微镜（Leica），细胞成像仪（BioTek公司），流式分析仪（BECK⁃MAN公司），酶标仪（BioTek公司）。

1.3 方法

1.3.1 人羊水间充质干细胞的收集、培养和传代扩增 通过羊膜腔穿刺术收集少量羊水组织，1 100 r/min离心5 min弃上清，用低糖DMEM完全培养基（含10%胎牛血清，4 ng/mL rBFGF）将细胞重悬后铺在25 cm2培养瓶中，再按3∶1比例加入BIO⁃AMFTM⁃2培养基，置37 ℃，5%CO2的培养箱中培养，5～7 d后用0.25%胰酶消化贴壁细胞，按1∶3传代。待细胞融合达80%左右，再用胰酶消化，每3～4天传代1次，连续传代3代后即可获得形态均一的间充质干细胞。

1.3.2 人羊水间充质干细胞的体外诱导分化 （1）成骨诱导分化：将传代扩增后的第4代AFMSCs以2×104接种于6孔板，待细胞融合达到80%以上后，吸去孔内培养液，PBS洗3次，诱导组加入成骨诱导液，对照组每孔加入L⁃DMEM完全培养液，置于培养箱培养，3天换1次诱导液，待诱导至第21天用茜素红-S染色的方法对成骨诱导分化进行鉴定。（2）成脂诱导分化：按成骨诱导分化的方法接种细胞，诱导组首先加入成脂诱导液诱导3 d，再用脂肪保持液处理1 d，如此循环3次，最后用脂肪保持液处理7 d。对照组加入DMEM完全培养基，每隔3～4 d换液。用油红O染色法对成脂分化进行鉴定。

1.3.3 细胞表面标志测定 细胞长满后用0.25%胰酶消化，1 200 r/min离心3 min，弃上清，PBS缓冲液洗涤2次，均分至EP管，加入相应的荧光标记抗体，4℃避光孵育45 min，离心，PBS缓冲液洗去未标记抗体，用200 μL PBS重悬，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44、CD105和HLA⁃ABC的表达。

1.3.4 细胞生长曲线绘制 取第7代培养的AFMSCs消化后铺于96孔板孔内，1 000个细胞/孔，37℃、5%CO2培养箱培养，待细胞贴壁状态良好，用CCK⁃8试剂盒测细胞数量，每孔加10 μL试剂，反应30 min用酶标仪测490 nm处的吸光度。每隔一天测一次，共测5次，每次测3个孔，取平均值。

1.3.5 不同培养代数人羊水间充质干细胞染色体核型的比较 取生长状态良好的第1代AFMSCs与传代至第30代的AFMSCs各一瓶，送往广州医科大学附属第一医院做染色体核型分析。

1.3.6 重组慢病毒颗粒的制备 转染前2 d将293FT细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达70%～80%以上时，将培养基换成不含抗生素的H⁃DMEM培养基。配制以下混合液：A：0.5 μg表达质粒（EGFP、hIFN⁃β、hIFN⁃γ）+SL3/SL4/SL5各0.25 μg+250 μL Opti⁃MEM，轻柔混匀；B：6 μL Lipo 2000+250 μL Opti⁃MEM，轻柔混匀，室温放置5 min；将B液加入A液，轻轻混匀，室温孵育15 min后，逐滴加入到含293FT细胞的6孔板中，置于细胞培养箱中，6 h后换成无双抗的H⁃DMEM培养基，48 h后收集富含慢病毒颗粒的培养上清。2 500 r/min离心2 min，除去细胞碎片后将含有病毒颗粒的上清液用0.45 μm滤器过滤，分装至1.5 mL EP管中，-20℃保存。

1.3.7 重组慢病毒颗粒感染人羊水间充质干细胞 取第4或5代状态较好的AFMSCs铺于6孔板内，细胞生长至80%融合时，换成新鲜培养液，1孔为不加任何慢病毒颗粒的阴性对照，其余3孔分别加入事先制备好的EGFP（阳性对照）、hIFN⁃β、hIFN⁃γ（实验组）慢病毒颗粒，感染12 h后换为DMEM培养基继续培养12 h，再次感染，连续感染2～3次达到较好效果，并观察细胞状态、荧光表达情况。

1.3.8 转染后间充质干细胞的纯化 在转染后第四天开始用1～3 mg/L的嘌呤霉素进行筛选，一般要筛选3轮，筛选的同时根据细胞生长增殖情况传代培养。

1.3.9 转染后间充质干细胞的鉴定分析 经嘌呤霉素筛选的AFMSCs传代至第4代时分别收集阴性对照组（AFMSCs）、阳性对照组（转染EGFP）和实验组（转染hIFN⁃β、hIFN⁃γ）的培养基上清，按照ELISA试剂盒说明检测上清液中hIFN⁃β、hIFN⁃γ的浓度。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件，实验数据中计量资料以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人羊水间充质干细胞的形态 最初从羊水中分离得到的细胞在培养瓶中成悬浮状态，原代培养5～7 d贴壁生长，早期贴壁细胞主要呈类上皮样、梭形或三角形，传代培养后细胞形态逐渐均一，多为成纤维样。见图1。

图1 第4代人羊水间充质干细胞形态（×40）Fig.1 The morphology of the fourth generation of AFMSCs

2.2 人羊水间充质干细胞具有多向诱导分化能力 成骨诱导21 d，茜素红染色可观察到深褐色钙沉积，见图2A；成脂诱导19 d，油红O染色可看到脂滴形成，见图2B。

图2 人羊水间充质干细胞体外诱导分化（×100）Fig.2 Induced differentiation in vitro of AFMSCs（× 100）

2.3 细胞表面标志测定 流式细胞仪分析结果显示，AFMSCs不表达CD34，高表达CD44、CD105和HLA⁃ABC。见图3。

2.4 人羊水间充质干细胞生长曲线 第7代细胞接种后，1 d贴壁，5 d内为缓慢生长期，5～7 d细胞进入对数生长期，7～9 d细胞达到生长平台期。见图4。

2.5 不同培养代数人羊水间充质干细胞染色体核型的比较 第1代AFMSCs（图5A）与第30代AFM⁃SCs（图5B）的核型比较结果显示，染色体核型均为正常二倍体核型，染色体数目均为2n=46条，染色体G带显示清晰。

图3 第4代人羊水间充质干细胞表面标志测定Fig.3 Surface marker determination of the fourth generation of AFMSCs

图4 第7代人羊水间充质干细胞生长曲线Fig.4 Growth curve of the seventh generation of AFMSCs

图5 人羊水间充质干细胞的的染色体（×1 000）Fig.5 The chromosome of AFMSCs（× 1 000）

2.6 慢病毒的包装结果 在荧光显微镜下观察，可见转染EGFP组大量293FT细胞表达强绿色荧光，见图6A，说明质粒转染进入293FT细胞效率较高；同时293FT细胞在病毒作用下融合状态较好，见图6A，B，C，有利于病毒颗粒的组装和释放，收集培养基并离心后可获得含病毒颗粒的上清液。

图6 慢病毒包装结果（bar：100 μm）Fig.6 Lentivirus packaged

2.7 慢病毒转染人羊水间充质干细胞 能够得到转染效率较高的AFMSCs，目的基因在细胞内表达。EGFP组转染2次后AFMSCs高表达EGFP，见图7A。在转染后第四天开始用嘌呤霉素进行筛选，经过3轮筛选得到稳定表达hIFN⁃β、hIFN⁃γ的AFMSCs。

图7 慢病毒转染人羊水来源间充质干细胞（bar：200 μm）Fig.7 Lentivirus transfection of AFMSCs

2.8 干扰素β和γ修饰的人羊水间充质干细胞的鉴定 Elisa检测结果显示，对照组和EGFP组均无hIFN⁃β、hIFN⁃γ 表达，而hIFN⁃β 修饰的AFMSCs组中干扰素β浓度为1 830 pg/mL，hIFN⁃γ修饰的AFMSCs组中干扰素γ浓度为65.33 pg/mL，表明hIFN⁃β、hIFN⁃γ基因成功转入AFMSCs中并高效表达，见图8。

3 讨论

关于MSCs的研究，标本多数从骨髓或脂肪组织中获取，但从骨髓获取MSCs对供体身体伤害相对较大，增殖分化潜能随年龄增大而下降；脂肪组织中所含MSCs比例较少且增殖能力不强。本实验从羊水中制备MSCs，具有取材相对方便和干细胞比例相对高的优势。目前认为MSCs没有特异性的表面标志物，已有研究表明其具有上皮细胞和内皮细胞的特征，不表达造血干细胞的表面标志。本研究的流式结果与相关报道一致，同时AFMSCs可稳定进行体外扩增，经过多次传代仍未见明显衰老痕迹且能保持正常核型；具有体外多向诱导分化能力。

图8 Elisa检测EFGP、hIFN⁃β和hIFN⁃γ修饰的AFMSCs表达hIFN⁃β、hIFN⁃γ的情况Fig.8 The expression of hIFN⁃β、hIFN⁃γ of AFMSCs modified by EFGP、hIFN⁃β和hIFN⁃γ

慢病毒颗粒的组装需要病毒包装质粒和表达质粒同时转染293FT细胞，本实验在转染携带hIFN⁃β、hIFN⁃γ基因的表达质粒的同时，另一组转染携带EGFP基因的表达质粒作为对照，因此根据绿色荧光蛋白表达情况可以判断质粒的转染效率及目的基因的表达效率。转染实验结果显示，慢病毒质粒转染后的293FT细胞融合状态良好，转染率较高，为高效感染AFMSCs提供了保证。感染实验结果表明携带EGFP的慢病毒颗粒感染AFM⁃SCs后能表达较强的绿色荧光蛋白，ELISA结果表明感染了携带hIFN⁃β、hIFN⁃γ的慢病毒颗粒的AFMSCs能够有效表达分泌型hIFN⁃β和hIFN⁃γ。

最近的研究结果表明MSCs输注具有良好的安全性和耐受性［4］，结合 MSCs的归巢特性［2］，MSCs作为细胞载体用于基因治疗的研究已经在体外和动物水平取得了较好的效果［5］。如IL⁃12修饰的MSCs抑制卵巢癌细胞增殖并诱导其凋亡［6］；Trail修饰的神经干细胞可追踪胶质瘤细胞，并可诱发其凋亡［7］；利用慢病毒包装系统制备的色素上皮衍生因子修饰的MSCs在体内外实验中均可抑制肝癌细胞生长和转移的能力［8］。

干扰素疗法作为肿瘤治疗中的重要一员，已被用于骨髓瘤［9］、恶性淋巴瘤［10］和肾细胞癌［11］等多种肿瘤的治疗。临床Ⅱ期试验证实静脉注射高剂量的IFN⁃β对黑色素瘤可发挥抗肿瘤作用，但会产生副作用，如流感样症状、疲劳、厌食症等；而静脉注射低剂量的干扰素在患者体内很快被降解，不能发挥抗肿瘤作用［12］。将AFMSCs用干扰素修饰后，高效表达干扰素的AFMSCs有望迁移到肿瘤部位，并在肿瘤部位大量表达目的基因，从而克服干扰素在临床应用中半衰期短、需反复给药以及大剂量给药有副作用等缺点，有望靶向性治疗肿瘤。干扰素除了具有抗肿瘤活性，还参与免疫调节。有文献报道，NO是MSCs介导免疫抑制作用的关键效应分子［13-14］，IFN⁃β可通过降低Stat1与iNOS启动子的结合来抑制MSCs产生NO，从而增强MSCs免疫反应并发挥抗肿瘤作用［15-16］；而IFN⁃γ则可以诱导MSCs生成NO，从而间接发挥免疫抑制作用并促进肿瘤生长［15］。因此，干扰素修饰的MSCs输注体内后是否引起患者免疫功能的变化以及IFN⁃β和IFN⁃γ修饰的MSCs抗肿瘤作用的差异也有待研究。

本实验成功制备出hIFN⁃β、hIFN⁃γ修饰的AFMSCs，为下一步将MSCs安全、高效地应用于肿瘤治疗研究奠定了基础。

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