脂肪酸转运蛋白-4在乳腺癌细胞转移中的作用及机制

毛英 黄湖南 王建荣 桂雄建 吴冰中国人民解放军第一八四医院普外科（江西鹰潭335000）；赣南医学院解剖教研室（江西赣州34000）

乳腺癌的女性发病率最高的恶性肿瘤，其高转移性是导致病死率高的主要原因，因此进一步探讨其转移的机制是乳腺癌治疗的热点问题［1-3］。脂肪酸转运蛋白4（fatty acid binding protein 4，FABP4）是一类将脂肪酸转运到各种细胞间的脂肪素，是脂肪代谢的重要调节因子，研究还发现其可以调节基因的表达、细胞的增殖分化等［4-5］。进一步的研究还发现，FABP4是促进宫颈癌［6］、肝癌［7］等细胞增殖、转移的重要因素。新近的研究也发现FABP4与乳腺癌的增殖密切相关［8］，但其在乳腺癌转移中的具体作用和机制鲜有报道。因此本研究进一步探讨在乳腺癌转移中的作用和机制，为乳腺癌的诊治提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 Transwell小室（Corning公司，美国），FABP4兔来源多克隆一抗（Abcam公司，美国），β⁃actin鼠来源单克隆一抗（CST公司，美国），抗兔或鼠HRP标记二抗（中杉金桥，北京），高糖型DMEM、胎牛血清（Gibco公司，美国），胰蛋白酶（吉诺公司，中国），新霉素和嘌呤霉素（sigma，美国），IL⁃33中和抗体（R&D Systems，美国）。

1.2 细胞培养 乳腺癌细胞ZR⁃75⁃30，BT⁃474，T⁃470，MCF⁃7，BT549和MDA⁃MB⁃231 由本院实验室保存细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在5%CO2的37℃孵箱中培养。

1.3 免疫组化 收集我院2015年1月至2017年12月乳腺癌患者手术标本的病理石蜡切片，其中未转移癌28例、转移癌41例。石蜡切片经脱蜡、抗原修复、5%羊血清封闭、FABP4一抗（1∶200）4℃孵育过夜，HRP标记兔二抗室温1 h，DAB显色。染色评分参考MENG等［9］的方法。

1.4 干扰RNA（shRNA）转染 shRNA由上海吉玛生物公司合成，系列参考TANG等［10］的报道。MDA⁃MB⁃231细胞转染按lip⁃2000的说明书进行。转染48 h，与新霉素0.2 μg/mL筛选，直至荧光显微镜下95%以上的细胞有荧光，Western blot检测蛋白水平。

1.5 慢病毒过表达 过表达FABP4蛋白的慢病毒由上海和元生物公司合成。按慢病毒滴度和细胞比1∶50进行转染MCF⁃7细胞，48 h后给予嘌呤霉素（20 ng/mL）筛选，直至荧光显微镜下95%以上的细胞有荧光，Western blot检测蛋白水平。

1.6 Western blot 提取全细胞蛋白，加入load⁃ing buffer后蛋白变性。SDS⁃PAGE胶分离蛋白（80 V，0.5 h后换100 V，1 h），转膜（冰浴，90 V，1.5 h）。封闭（5% 脱脂奶粉，室温，2 h），5%BSA稀释FABP4、β⁃actin一抗（1∶1 000）4℃过夜孵育。二抗（1∶5 000）常温1 h，TBST 洗膜后ECL显影。

1.7 ELISA IL⁃33检测参照eBioscience公司（美国）ELISA试剂盒说明进行。

1.8 Transwell 50 mg/L Matrigel 1∶5稀释液，50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。细胞消化后用无血清培养基DMEM制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL。吸取200 μL细胞悬液加入Transwell小室上室，下室加入含10%血清的DMEM 600 μL。18 h后取出小室，去除培养基，4%多聚甲醛固定10 min后，结晶紫染色2 h，显微镜下拍照。

1.9 裸鼠转移实验 40只雌性BALC/c裸鼠购置南方医科大学动物实验心中，参照南方医科大学动物实验的要求，饲养我院SPF级动物房。20只雌性BALC/c裸鼠，5 × 106个MDA⁃MB⁃231鼠尾静脉注射，随机分为两组，腹腔注射人源IL⁃33中和抗体（IL⁃33 nAb）10只及腹腔注射controlIgG（CtrlAb）10只。20只雌性BALC/c裸鼠，5 × 106个过表达FABP4的MCF⁃7细胞鼠尾静脉注射，随机分为两组，腹腔注射人源IL⁃33中和抗体（IL⁃33 nAb）10只及腹腔注射control IgG（Ctrl Ab）10只。42 d后收集肺组织，石蜡包埋切片HE染色后，观察每个肺叶切片的癌转移结节。

1.10 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件，采用One⁃way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法进行方差齐性检验，确定方差齐性且整体比较组间差异有统计学意义后进一步作多重比较，多重比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FABP4在乳腺癌中的表达水平 笔者首先检测了乳腺癌患者手术标本石蜡切片中FABP4表达的水平，结果显示与未转移癌标本相比，发生转移的乳腺癌组织中FABP4表达显著增加（图1A）。同时，在高转移性的乳腺癌细胞ZR⁃75⁃30，BT549和MDA⁃MB⁃231胞浆蛋白和细胞培养基上清中FABP4表达都较低转移的乳腺癌细胞BT⁃474，T⁃470和MCF⁃7的高（图1B和C）。由此提示，高表达的FABP4与乳腺癌的转移相关。

2.2 FABP4对乳腺癌转移的影响 通过transwell实验，笔者发现使用敲低高转移性的MDA⁃MB⁃231细胞FABP4表达后，其转移能力被明显抑制（图2A和B）；在低转移的MCF⁃7细胞中加入过表达FABP4后，其转移能力明显增强（图2C和D）。由此可见，FABP4可以促进乳腺癌的转移。

2.3 FABP4对乳腺癌细胞IL⁃33表达的影响 高转移的乳腺癌细胞 ZR⁃75⁃30，BT549和MDA⁃MB⁃231细胞培养基上清中IL⁃33表达都较低转移的乳腺癌细胞BT⁃474，T⁃470和MCF⁃7的显著增多（图3A）。敲低FABP4的MDA⁃MB⁃231细胞，其IL⁃33分泌明显减少（图3B）；而在过表达FABP4的MCD⁃7培养基上清中，IL⁃33显著减少（图3C）。由此可见，FABP4可以促进IL⁃33的合成分泌。

2.4 IL⁃33在FABP4促进乳腺癌转移中的作用 首先用IL⁃33中和抗体阻断高转移的MDA⁃MB⁃231细胞分泌的IL⁃33，发现其转移能力被明显抑制（图4A和C）；同时，笔者也观察到在过表达FABP4的MCF⁃7细胞其转移能力也能被IL⁃33中和抗体抑制（图4B和D）。由此提示：FABP4可能是通过增加乳腺癌细胞分泌IL⁃33进而促进乳腺癌转移。

图1 FABP4在乳腺癌中的表达水平Fig.1 The expression of FABP4 in breast cancer

图2 FABP4对乳腺癌转移的影响Fig.2 The effect of FABP4 on breast cancer metastasis

图3 FABP4对乳腺癌细胞IL⁃33表达的影响Fig.3 The effect of FABP4 on IL⁃33 expression of breast cancer cells

图4 IL⁃33在FABP4促进乳腺癌转移中的作用Fig.4 The effect of IL⁃33 on FABP4 induced breast cancer metastasis

3 讨论

FABP4是一类重要的脂类伴侣，在脂质介导的细胞生理过程和代谢中发挥重要作用。研究发现，FABP4非小细胞肺癌［11］、胰腺导管癌［12］等的疾病进展有非常密切的关系；进一步的也发现FABP4可通过促进EMT等促进肿瘤细胞的侵袭［6］。在乳腺癌的研究中发现，FABP4可以促进乳腺癌细胞的增殖；但体外实验中，运用重组的FABP4未发现其可以显著促进乳腺细胞迁移［8］。但在本研究中，通过对比临床患者手术标本发现，发生转移的患者乳腺癌组织中FABP4表达较未发生转移的显著增多；高转移的乳腺癌细胞中FAPB4表达和分泌都较低转移的多；进一步，在敲低高转移能力的MDA⁃MB⁃231的FAPB4表达，可以抑制其侵袭转移；而在低转移能力的MCF⁃7细胞过表达FAPB4，可促进其侵袭转移。

为什么有如此的差异呢？对比XIE等［6］宫颈癌中的研究，MASANA等使用的eFAPB4只有100 ng/mL，而XIE等在100 ng/mL也未发现其有促进宫颈癌细胞的转移，在500 ng/mL中的作用非常明显。结合本研究结果，认为FABP4有促进乳腺癌转移的作用。

肿瘤相关炎症反应在肿瘤的发生、发展中有重要的作用，现有研究已经表明肿瘤组织周围的炎症因子如IL⁃1、IL⁃6、CXCL9等可以促进肿瘤的增殖和转移［13］。IL⁃33是一类IL⁃1家族细胞因子，其与炎症反应［14］、神经系统疾病［15］、纤维化［15］和肿瘤［17］等都有密切的关系。在乳腺癌研究中，发现 IL⁃33 可以促进乳腺癌的增殖［18］、EMT［19］、肿瘤耐药［20］等。笔者也观察到在高转移能力的乳腺癌细胞中IL⁃33表达显著增高。并且，敲低FABP4表达后，MDA⁃MB⁃231细胞分泌IL⁃33减少；而过表达FABP4的MCF⁃7细胞，IL⁃33分泌增加。也有研究发现，FABP4 有调节炎症反应的作用［10，21］。由此可见，FABP4可以调控肿瘤细胞IL⁃33的分泌。那么，FABP4是否通过IL⁃33来调节乳腺癌细胞的侵袭转移？使用IL⁃33中和抗体后，FABP4促进乳腺癌侵袭转移的能力被显著抑制。

综上所述，笔者认为FABP4可以促进乳腺癌侵袭转移，其机制与调控IL⁃33的表达有关。这可以为乳腺癌的防治提供新的靶点。但FABP4是如何调控IL⁃33表达分泌的还需要进一步探讨。

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