白藜芦醇在体外通过自噬作用抑制宫颈癌细胞增殖的研究

孙传名，方文秀，周荣生，汪陶荣，赵卫东，陈晓宇

宫颈癌是女性生殖系统最为常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈逐年升高趋势[1]。植物抗毒素白藜芦醇(resveratrol，Res)是从花生、虎杖、葡萄等植物中提取的多元酚类，生物学和药理学活性广泛，研究[2-3]显示其具有抗炎、抗氧化、预防肿瘤和抗老化等特性。真核生物体内细胞内衰老、变性、受损的细胞器需依赖细胞内自噬-溶酶体途径降解，从而调节细胞器质量，稳定细胞内环境，防止致突变物质聚集于细胞或发生基因突变[4]。Res抗宫颈癌HeLa细胞作用已有文献[5]报道，但关于自噬在Res对宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制中的作用研究报道较少。该研究在体外采用不同浓度Res处理人宫颈癌HeLa 细胞，检测Res对HeLa 细胞的增殖抑制和促进凋亡作用，同时，检测Res诱导HeLa 细胞自噬情况，探讨Res对宫颈癌HeLa 细胞部分作用机制。

1 材料与方法

1.1实验试剂和主要仪器白藜芦醇(纯度≥99%，美国Aladdin Sigma公司，用时稀释于培养液)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(美国Genview公司)；培养基RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；二甲亚砜(DMSO)、Hoechst 33258染液、青霉素和链霉素溶液、蛋白预染Marker、一抗稀释液、ECL化学发光液(上海碧云天生物有限公司)；BCA蛋白试剂定量盒(美国Pierce公司)；一抗：兔抗人微管相关蛋白1的轻链3(light chain 3 of the microtubule associated protein 1，LC3A/B)、p62、Beclin-1、GAPDH多克隆抗体(美国Cell signaling 公司)；二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔多克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司)；硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜(美国Millipore公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；CO2培养箱、多功能酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；激光共聚焦显微镜(德国Lecia公司)；半干转膜仪(大连竞迈生物科技有限公司)。

1.2宫颈癌HeLa细胞培养和细胞增殖实验HeLa 细胞株常规培养于含10% FBS的RPMI-1640培养液中(内置1%青霉素和链霉素双抗)，置于37 ℃、5% CO2孵箱中单层传代培养。按照5×103/孔将处于对数生长期的HeLa 细胞接种于96孔细胞培养板中。HeLa细胞分为对照组、白藜芦醇组。对照组只加RPMI-1640培养液，白藜芦醇组(加入Res 5、10、20、50、100 μmol/L处理)，细胞培养48 h后，加入MTT溶液继续培养4 h，再用DMSO 振荡溶解，于波长490 nm下酶标仪读取吸光度(absorbance，A)值即A490值。按下列公式计算增殖抑制率：增殖抑制率(%)= (对照组A490-白藜芦醇组A490)/对照组A490×100 %。

1.3Hoechst33258染色检测Res处理HeLa细胞后的细胞凋亡情况取对数生长期的HeLa细胞，按照5×103/孔接种于96孔细胞培养板中，贴壁培养24 h后，予不同浓度Res(0、5、30、100 μmol/L)处理48 h，吸尽培养液，4%多聚甲醛溶液固定15 min， PBS清洗固定后的HeLa细胞2次，每次10 min，弃去清洗液并吸干，30 μl染色液Hoechst 33258避光染色10 min，PBS清洗，2次，每次10 min，荧光显微镜下观察拍照。

1.4免疫细胞化学观察Res处理HeLa细胞后LC3A/B抗体表达按照1.0×105/孔将处于对数生长期的HeLa 细胞接种于6孔细胞培养板中，培养24 h后，加入Res，使其终浓度为20、100 μmol /L，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，吸尽培养液，4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS漂洗HeLa细胞3次，每次10 min。加入0.1% TritonX-100 透膜10 min，PBS 漂洗HeLa细胞3次，每次10 min。山羊血清封闭1 h，勿洗，加入1 ∶150稀释的兔抗人LC3A/B多克隆抗体，4 ℃孵育过夜。次日PBS 漂洗3次，每次10 min后，加入1 ∶100 稀释的FITC 标记羊抗兔IgG，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次，每次10 min；加入DAPI 染核5 min，应用抗荧光淬灭剂封固，Lecia激光共聚焦显微镜摄片。

1.5Westernblot法检测Res处理HeLa细胞后p62、Beclin-1蛋白表达25 ml培养瓶中按照1.0×106/孔将处于对数生长期的HeLa 细胞接种，每瓶加入含10% FBS的RPMI-1640培养液5 ml，培养24 h 后，加入不同浓度Res(0、10、30、100 μmol /L)处理48 h，RIPA裂解液提取总蛋白，Bradford 法测定蛋白浓度，取30 μg总蛋白SDS-PAGE电泳(分离胶10%， 浓缩胶5%)分离，半干转膜仪转移至PVDF膜1 h，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，在4 ℃孵育p62、Beclin-1 蛋白一抗过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光，曝光压片，显影、定影。Alpha 化学发光凝胶成像系统照相记录结果。

2 结果

2.1不同浓度白藜芦醇对HeLa细胞增殖情况的影响将对照组(只RPMI-1640 培养液)的细胞增殖的抑制率设为0，与对照组比较，白藜芦醇组(加入Res 5、10、20、50、100 μmol/L)处理后，HeLa细胞增殖的抑制率逐渐增高，分别为(9.2%±1.5%)、(13.4%±1.7%)、(20.1%±2.1%)、(32.6%±2.3%)、(40.4%±2.8%)，与对照组比较，差异有统计学意义(F=38.17，P<0.01)，见图1。

图1 不同浓度白藜芦醇对HeLa 细胞增殖情况的影响

2.2Res处理HeLa细胞后的细胞凋亡情况倒置显微镜下，与对照组(0 μmol/L Res)相比，HeLa细胞经过不同浓度Res溶液(5、30、100 μmol/L)刺激48 h 后，HeLa细胞则呈不规则梭形、巢状聚团生长。荧光显微镜下，Hoechst 33258 染色后于观察可见，细胞核变形或皱缩，核染色质进一步聚集、断裂，呈月牙状或明亮颗粒状蓝色荧光，可见明显凋亡小体。且随着Res浓度的升高，核凋亡现象更加明显。见图2。

图2 不同浓度Res处理HeLa细胞后的细胞凋亡情况 Hoechst 33258染色×100

2.3Res处理HeLa细胞后LC3A/B表达的影响在激光共聚焦显微镜下观察可见，LC3A/B 绿色荧光较为均匀的分布于对照组HeLa 细胞的胞质和胞核中，荧光强度相对较弱；不同浓度的Res处理HeLa细胞后，HeLa 细胞的胞质和胞核中LC3A/B 绿色荧光强度明显增强，且较不均匀，以Res高浓度(100 μmol /L)明显，见图3。

2.4Westernblot法检测Res处理HeLa细胞后p62和Beclin-1蛋白表达情况Western blot 检测结果表明，与对照组比较，使用白藜芦醇不同浓度(10、30、100 μmol /L)处理HeLa 细胞48 h 后，随着白藜芦醇浓度增高，p62 蛋白表达逐渐降低，而Beclin-1 表达逐渐增强。经统计分析表明，与对照组p62 蛋白表达(0.46±0.09)比较，不同浓度白藜芦醇(10、30、100 μmol /L)处理HeLa 细胞的p62 蛋白表达(0.35±0.08)、(0.29±0.06)、(0.22±0.05)差异有统计学意义(F=25.71，P<0.01)；与对照组Beclin-1蛋白表达(0.18±0.05)比较，不同浓度白藜芦醇(10、30、100 μmol /L)处理HeLa 细胞的Beclin-1 蛋白表达(0.29±0.07)、(0.41±0.08)、(0.53±0.11)差异有统计学意义(F=42.07，P<0.01)。见图4。

图3 不同浓度Res处理HeLa细胞后LC3A/B 表达激光共聚焦 ×400

A：对照组；B：Res 5 μmol/L；C：Res 30 μmol/L；D：Res 100 μmol/L

图4 Res处理HeLa细胞后p62 和Beclin-1 蛋白表达影响

1：对照组；2：Res 5 μmol/L；3：Res 30 μmol/L；4：Res 100 μmol/L；与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

妇科恶性肿瘤宫颈癌发病率高、恶性程度大，我国每年约有2万余名妇女死于宫颈癌[1]。为改善宫颈癌患者预后，降低放疗、化疗副反应和复发率，科研人员作出不断研究。天然的多酚类化合物Res具有广泛的生物学和药理学活性，在植物虎杖、葡萄、花生等广泛分布芪类化合物，研究[2,6]显示其具有抗氧化、抗炎作用，可显著抑制肺癌、乳腺癌、神经胶质细胞瘤、肝癌、肾癌等多种肿瘤细胞生长。本研究通过人宫颈癌HeLa细胞为对象，观察Res对宫颈癌细胞生长的影响。MTT检测结果表明，不同剂量Res对宫颈癌HeLa 细胞增殖有抑制作用，该抑制作用呈剂量依赖性。

细胞凋亡是细胞在基因调控下，为适应外界环境的影响主动程序死亡的过程，在肿瘤的发生发展关系密切，形态学上，凋亡细胞变形且体积缩小，贴壁培养细胞会出现变圆、皱缩、脱落，细胞核染色质浓缩、边聚，分割成块状和凋亡小体等。Hoechst 33258是常用的DNA特异性染料，与DNA非嵌入式的结合DNA的A-T碱基区，通过荧光显微镜，紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光[7]。本研究在Hoechst 33258 染色荧光显微镜下观察到，Res处理组宫颈癌HeLa 细胞的胞核变形或皱缩，核染色质聚集呈月牙状或明亮颗粒状蓝色荧光，且随着Res浓度的升高，核凋亡现象更加明显。表明不同剂量Res可促进宫颈癌HeLa 细胞凋亡形成。

恶性肿瘤的发展进程中会表现出自噬功能失调，且与其损伤DNA、降低染色体稳定性有关[8]。自噬是机体细胞为适应低氧、饥饿、营养夺获和环境应激(如药物应用)的自我保护机制，导致肿瘤抵抗治疗作用，故调节自噬可以有效预防和治疗肿瘤，提高肿瘤治疗过程中的化疗耐药，为肿瘤治疗提供新的思路[9]。在激光共聚焦显微镜下，观察到Res处理组HeLa 细胞后细胞质中可见大量LC3A/B 绿色荧光分布，且荧光强度较对照组增强。LC3A/B是自噬标记蛋白，检测细胞LC3A/B 荧光强度可作为自噬活性的标志。本研究显示在对照组宫颈癌HeLa 细胞中LC3A/B 荧光强度较弱，明显低于不同浓度Res治疗组，表明LC3A/B 表达下调，甚至缺失存在于宫颈癌HeLa 细胞中；Res升高宫颈癌HeLa 细胞LC3表达，增强了HeLa 细胞的自噬活性或潜能。

研究[10]表明，自噬对肿瘤生长起到抑瘤作用，Beclin-1是另一种重要的自噬标记蛋白，Beclin-1基因敲除的小鼠患恶性肿瘤比野生型小鼠容易，缺失Beclin-1基因时，细胞内积累更多的异常细胞器和蛋白质；而自噬标记蛋白p62 失活会引起自噬功能障碍，DNA损伤，易引起肿瘤发生，p62 表达上升是自噬损伤的标志，饥饿、营养夺获和环境应激等可上调p62 基因转录，促进从头合成p62 蛋白[11]。本研究Western blot结果显示，与对照组比较，Res可浓度依赖性的升高HeLa 细胞Beclin-1 表达；且Res可浓度依赖性降低HeLa细胞p62蛋白表达。表明Beclin-1、p62蛋白表达对HeLa细胞自噬活性有一定的影响，Res可以通过调节Beclin-1、p62 的表达量而影响HeLa 细胞自噬。