预防性应用头孢硫脒对早产儿早期免疫功能的影响

李 凯，孙 美，李 略，王清萍，张士发

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 儿科，安徽 芜湖 241001)

早产儿因各器官和系统发育不成熟，出生后需入住新生儿重症监护病房(neonatal intensive care unit,NICU)，早产儿在生后第一周内为细菌、病毒感染的高危人群[1]，为预防感染的发生，目前国内外多数NICU对于具有发生感染高危因素的早产儿，生后即刻给予预防性抗生素治疗[2-3]。而β-内酰胺类抗生素是最广泛使用的抗生素[4]，国外专家推荐使用青霉素联合氨基糖甙类[5]，而氨基糖甙类在国内禁用；注射用头孢硫脒(cefathiamidine for injection)为我国研制的第一代头孢菌素[6]，较常用于预防性抗感染治疗。早产儿生后即刻预防性应用头孢硫脒是否对早产儿免疫功能状态产生一定的影响？目前相关报道较少。本研究拟通过观察头孢硫脒应用前后对胎膜早破早产儿外周血淋巴细胞亚群CD3+CD4+、CD3+CD8+T、CD16+CD56+、CD19+细胞比例及Th亚群(Th1/Th2)平衡状态的变化，初步了解注射用头孢硫脒对早产儿部分免疫功能的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年12月～2016年11月我院NICU收住的早产儿。经医院伦理委员会批准，患儿家长签署知情同意书，将符合入选标准的早产儿，按入院时间先后顺序进行序列编号，通过随机数字表获得80个随机数字，根据随机号大小分组，大号为预防组，小号为对照组。预防组入院后即刻应用头孢硫脒(广州白云制药股份有限公司)，50 mg/(kg·d)，q12 h，静脉滴注，疗程48～72 h[5]；对照组，暂不使用任何抗生素。两组患儿入院后均实施感染筛查和监测相结合的措施，立即行外周血白细胞计数分类、CRP、降钙素原(procalcitonin, PCT)、血培养等感染指标筛查，每6～12 h复查，持续监测至入院后72 h，预防组排除感染，停用抗生素；如确诊感染，结合临床表现及生物学指标，及时调整抗生素。对照组在监测期间出现感染的临床表现及时加用相应抗生素。两组早产儿入院后立即入暖箱，并开始早产儿配方奶喂养，辅以肠道外营养(外周静脉)。

1.1.1 入选标准 胎龄为32～34+6周，入院年龄≥6 h但<24 h，临床表现稳定、无明确感染症状、胎膜早破时间﹤18 h[3]、自然分娩的早产儿。

1.1.2 排除标准 有家族免疫缺陷病、先天性免疫缺陷、先天畸形、入院时确诊感染及母亲产前发热、感染或曾使用糖皮质激素等免疫抑制剂或抗生素的早产儿均不纳入本研究。

1.1.3 退出标准 所有入选病例，入院后2周内出现下列任何一种情况退出本研究，如需要各种呼吸支持、其他侵入性操作如气管插管、中心静脉置管等，确诊为感染或出现并发症，特殊药物的使用(肠道益生菌、血浆、丙种球蛋白、白蛋白、糖皮质激素、H2受体阻滞剂等)，住院时间<2周。

1.2 标本的采集及指标检测 各组早产儿于出生后第1天(postnatal day 1，P1)治疗前和P14经桡动脉取血3 mL，1.5 mL血样EDTA抗凝，4 000 r/min离心5 min，取上清液放于-70 ℃低温冰箱保存备用。采用ELISA检测血浆干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和白介素-4(Interleukin-4,IL-4)水平(试剂盒均由南京森贝伽工程股份有限公司提供)。另1.5 mL血样EDTA抗凝,于12 h内进行淋巴细胞亚群检测，采用Beckman Coulter公司Epics XL型流式细胞仪及Epics Software 进行总T细胞(CD3+)、辅助性T淋巴细胞(T helper lymphocytes, Th;CD3+CD4+)、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL; CD3+CD8+)、自然杀伤细胞(natural killer, NK;CD16+CD56+)和B细胞(CD19+)的检测和数据分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理分析。非正态分布的计量资料采用中位数(四分位间距)[M(P25，P75)] 表示，用非参数检验的Mann-Whitney U检验；正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；计数资料采用百分率表示，两组间的比较采用χ2(校正)检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组共65例早产儿完成研究，其一般情况无统计学差异(见表1)。共16例退出本研究，对照组9例，2例确诊感染，1例发生新生儿呼吸窘迫综合征，2例因喂养不耐受行外周静脉穿刺中心静脉置管术，3例因呼吸暂停行辅助通气，1例发生肺出血；预防组7例，1例确诊感染，2例发生新生儿呼吸窘迫综合征，2例因喂养不耐受行外周静脉穿刺中心静脉置管术，2例因呼吸暂停行辅助通气。

表1 两组完成研究的早产儿一般情况比较

组别n性别男女胎龄M(P25,P75)/周出生体质量(x±s)/kgApgar评分M(P25,P75)胎膜早破时间M(P25,P75)/h对照组3219 1333(32,33.8)1.92±0.398(8,9)6(4,11.8)预防组33181533(32,33.5)1.90±0.298.5(8,9)7(4,13)χ2/Z/t0.1550.7080.2361.4990.436P0.8040.4790.8140.1340.663

2.2 淋巴细胞亚群 P1，两组早产儿外周血各淋巴细胞亚群的百分率及CD4+/CD8+比值的比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。至P14，预防组早产儿外周血CD3+CD4+T细胞百分率均低于对照组(49.90±8.53%vs. 54.61±6.38%,t=2.51,P=0.02)，CD3+CD8+T细胞百分率高于对照组(21.87±3.44 %vs. 18.34±5.24%,t=-3.22,P=0.00)，CD4+/CD8+比值低于对照组(2.36±0.71vs. 3.25±1.10,t=3.87,P=0.00)，CD16+CD56+细胞百分率低于对照组[4.11(2.65,5.10) %vs. 7.91(5.93,9.45) %,Z=-4.86,P=0.00]，上述的差异均有统计学意义(P<0.05)；CD19+细胞百分率高于对照组[(11.18(8.5,12.1)vs. 9.86(8.95,11.28),Z=-1.33,P=0.16]，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 Th1、Th2类细胞因子INF-γ、IL-4水平及Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)比值 P1，两组早产儿血浆INF-γ、IL-4水平和IFN-γ/IL-4的比值的比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。至P14，预防组INF-γ水平低于对照组(238.40±7.79vs. 243.57±6.18，t=2.96,P=0.00)，IL-4水平高于对照组(246.87±6.39vs. 230.30±8.71,t=8.76,P=0.00) ，IFN-γ/IL-4比值低于对照组(0.967±0.422vs. 1.060±0.053,t=7.78,P=0.00)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

早产儿出生后最初几周是早产儿固有免疫发育的重要“窗口期”，此期接触的各种不同刺激均可能改变固有免疫发育的“轨迹”[7]，其中抗生素暴露是早产儿早期接受最频繁的刺激之一[8-9]。早期静脉预防性应用头孢硫脒，将有可能导致早产儿在早期发生免疫功能失衡。

本研究结果发现：静脉预防性应用头孢硫脒在早期已对早产儿的CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD16+CD56+细胞、CD19+细胞及CD4+/CD8+比值产生一定的影响。树突细胞(dendritic cells,DCs)数量、分泌的细胞因子类型及其表达的主要组织相容性复合体分子类型的变化将影响T细胞增殖后向Th细胞和CTL细胞分化方向[1]，从而导致CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞百分率和CD4+/ CD8+比值发生变化。Gonzalez-Perez等研究发现[10]，孕鼠分娩前应用抗生素治疗3～5 d，子代新生小鼠NK细胞百分率明显减少。B细胞(CD19+)不仅作为APCs参与调节T 细胞的活化，同时也可接受其他APCs提呈的抗原刺激而活化，其在外周血百分率与年龄呈负相关[11]。上述的结果表明，早产儿预防性应用头孢硫脒，可能导致早产儿在早期发生部分免疫功能的失衡。

CD3+CD4+T细胞在不同种类细胞因子的调控下将进一步分化为不同亚群，新生儿出生后Th1和Th2细胞亚群间的平衡受多种因素影响[12]。乳酸杆菌、双歧杆菌、厚壁菌门可上调肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue,GALT)中DCs的IL-12、IFN-γ mRNA表达[13]。早产儿预防性应用头孢硫脒后，可能因肠道微生物群的失调而下调DCs的 IL-12、IFN-γ mRNA表达，加之低百分率的 NK细胞，导致IL-12等细胞因子刺激NK细胞分泌的IFN-γ水平进一步减低，致使Th分化发生偏移，不利于其向Th1细胞的方向分化，影响Th1和Th2细胞亚群之间的平衡。有研究发现[14]，T细胞摄取β-内酰胺类抗生素共价修饰血浆的白蛋白，上/下调许多和T细胞分化相关的基因表达，因此头孢硫脒也可能通过上调Th2分化相关基因表达，影响早产儿Th1和Th2细胞亚群间的平衡。本研究表明预防性应用头孢硫脒可能导致早产儿在新生儿早期Th细胞分化趋于Th2极化。

总之，出生后即刻静脉预防性应用头孢硫脒，对早产儿早期的固有和适应性免疫应答均可能产生一定影响，CD4+/CD8+比值和NK细胞百分率下降，Th1/Th2平衡趋于Th2方向，并对B细胞也产生一定影响，但是否增加日后发生免疫性及过敏性疾病的风险还需进一步研究。

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