电针对脑缺血大鼠海马CA3区NGF和Gas7表达的影响

丁 见，吴 锋，缪化春，李怀斌，熊克仁

(皖南医学院 人体解剖学教研室，安徽 芜湖 241002)

脑缺血是临床常见疾病，具有高致残率、高病死率的特点，其病理过程较为复杂，缺血病灶区局部甚至远离缺血区部位都会出现不同程度的损伤[1]。大脑内不同部位对缺血缺氧损害敏感程度有差异，海马是其中较为敏感的部位，也是大脑内具有重要功能的结构[2]。针刺作为中国传统的“非药物”治疗手段，对脑缺血后神经、血管再生具有显著的临床效应[3]。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和生长休止特定蛋白7(growth arrest-specific protein 7,Gas7)对中枢神经系统的再生和修复有着重要的作用，具有维持神经元存活、参与受损神经元修复等功能[4-5]。前期研究显示，电针可通过上调大鼠缺血侧丘脑腹后外侧核NGF和Gas7的表达，从而对神经元起到一定保护作用[6]，但电针对海马CA3区NGF和Gas7表达的影响尚未见报道。本研究通过建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型，观察电针刺激“百会”和左侧“足三里”穴对脑缺血损伤后海马CA3区NGF和Gas7表达的影响，探讨电针对大鼠脑缺血后损伤的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SD大鼠24只，清洁级成年雄性，体质量(200±20)g，许可证号：SCXK(苏)2014-0007。适应性饲养7 d后，大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组，每组6只。

1.2 药品及试剂 戊巴比妥钠，美国Sigma公司；NGF一抗，北京博奥森生物技术有限公司；Gas7一抗，Santa Cruz公司；浓缩型SABC-POD试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；PBS漂洗缓冲液，武汉博士德生物工程有限公司；多聚赖氨酸(Poly-L-lysine)，武汉博士德生物工程有限公司；DAB底物显色试剂盒，北京天根生化科技有限公司。

1.3 模型制备 参照本研究前期建立的MCAO模型制作方法[6]，大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后仰卧于实验台上，颈部剃毛、消毒后做正中切口，分离出右侧颈总动脉(CCA)，分离颈外动脉(ECA) 、颈内动脉(ICA) 颅外段。将CCA近心端结扎，ECA结扎。于右侧颈总动脉近分叉处作一小切口，插入预先准备的直径0.26 mm尼龙线，深度(18.5±0.5)mm，用备线扎紧，清创，缝合皮肤。同时制备假手术组作为对照，仅暴露右侧CCA、ECA及ICA，逐层缝合，正常进水进食。

1.4 干预方法 造模成功1周后，电针组参照中国针灸学会实验针灸委员会制定的实验动物穴位图谱，以30号1寸毫针取“百会”穴斜刺入头皮1 mm，直刺左侧“足三里”穴2 mm。针柄连接至电针仪(苏州医疗用品厂有限公司，型号：SDZ-Ⅱ)，给予低频(2 Hz) 电流刺激，强度为2 V，波宽为1 ms，持续30 min，每日1次，连续3周。其余3组不予干预。

1.5 标本采集与形态学检测 以1% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸，用插管经左心室-升主动脉灌注4%多聚甲醛，灌注后取脑，参照大鼠脑立体定位图谱[7]进行分段，将分段后的脑组织放入4%甲醛固定24 h后石蜡包埋。常规石蜡切片(厚5 μm)，以涂有多聚赖氨酸的载玻片贴片后按SABC免疫组织化学染色试剂盒步骤进行操作，DAB显色，中性树胶封片。切片中选取相同冠状切面，每组10张，在光学显微镜采用400倍视野对CA3区进行观察拍照，采集照片相同区域内用Image J 软件对NGF和Gas7阳性神经细胞进行计数并测量平均灰度值。

2 结果

2.1 神经元形态学比较 正常组及假手术组CA3区尼氏染色后镜下结构境界清晰，淡染，排列较为整齐，神经元形态完整，胞核居中，胞质丰富。模型组大鼠患侧海马锥体细胞层次减少、排列紊乱，神经细胞形态不规则增多。电针组大鼠神经元细胞形态有改善，缺血侧细胞萎缩状况较模型组减少(见图1)。

A.正常组；B.假手术组；C.模型组；D.电针组。

图1 各组大鼠右侧海马CA3区神经元尼氏染色

2.2 NGF蛋白在各组右侧海马CA3区表达的比较 各组大鼠右侧海马CA3区均有NGF的表达。NGF免疫阳性产物主要着色部位为神经元的胞膜与胞质，阳性神经元着色呈棕黄色。正常组可见少许淡染的NGF阳性神经元；模型组CA3区NGF阳性神经元数量增多(P<0.01)，染色加深，细胞平均灰度值较正常组降低(P<0.01)；电针组与模型组比较，CA3区NGF阳性神经元数量均增多(P<0.01)，免疫阳性细胞平均灰度值降低(P<0.01)；与正常组比较，假手术组右侧CA3区NGF阳性表达差异无统计学意义(P>0.05),见表1、图2。

与正常组比较aP<0.01;与模型组比较bP<0.01;与正常组比较 cP>0.05。

A.正常组；B.假手术组；C.模型组；D.电针组。

图2 NGF在大鼠右侧海马CA3区的表达

2.3 Gas7蛋白在各组右侧海马CA3区表达的比较 Gas7阳性神经元呈棕黄色，着色部位主要为胞膜和胞质，细胞多呈圆形，少数呈椭圆形。正常组CA3区可见少量淡染的Gas7阳性神经元。模型组Gas7阳性细胞数较正常组增多(P<0.01)，细胞染色加深，细胞平均灰度值降低(P<0.01)；电针组Gas7阳性神经元呈深染状态，与模型组比较，细胞数增多(P<0.01)，平均灰度值降低(P<0.01)；与正常组相比较，假手术组CA3区Gas7阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图3。

3 讨论

缺血性脑血管病是临床常见疾病，具有致残率高的特点，严重威胁着人类的健康及生存质量，防治缺血性脑血管病一直是临床关注的重点，也是目前医学研究的热点。针灸作为中医学治疗手段，受到各国临床医学界的高度重视，其可明显改善脑缺血后神经功能损害症状，提高患者生活质量，现已广泛应用于脑缺血后的治疗[8]。传统观念认为，中枢神经系统损伤后不能修复，但人们近年对神经干细胞的研究发现，在海马终身存在着内源性神经干细胞，脑损伤可刺激体内神经再生区的神经干细胞増殖、分化，进行自我修复。但大脑的自身修复能力有限，而电针可通过改善机体血氧代谢方面对脑缺血起治疗作用[9]，发挥延缓脑损伤的保护作用，使大脑神经的功能和形态损害减轻。本研究探讨脑缺血后电针“百会”、“足三里”穴对脑的保护作用并研究其中可能的作用机制。通过尼氏染色观察到模型组大鼠患侧海马CA3区神经元出现损伤，以此验证了模型的成功与稳定性，可以用于研究电针对MCAO模型大鼠海马CA3区NGF和Gas7表达的影响。通过为期21 d的电针干预治疗以后，电针组大鼠缺血区神经元萎缩状况明显好转，说明电针具有较好的良性调节作用，可在一定程度上减少脑缺血对神经元带来的损害。

A.正常组；B.假手术组；C.模型组；D.电针组。

图3 Gas7在大鼠右侧海马CA3区的表达

神经干细胞终身存在于哺乳动物脑内，脑缺血缺氧后神经细胞存在一定的自身保护机制，机体可上调一些内源性神经营养因子的表达，降低脑神经细胞损伤程度。NGF是发现最早的一类神经营养因子，具有抗氧化、抗调亡、抑制兴奋性氨基酸神经毒性等多种作用，可保护效应神经元，促使损伤神经再生。局灶性缺血损伤后NGF的表达会上调，参与神经元再生的调节。NGF是具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，可促进缺血后神经元的存活和生长发育并能够防止它们受损死亡，改善神经元的病理状态，促进受损神经元再生及分化成熟，在损伤修复中具有重要作用[10]。大量研究表明，NGF对缺血缺氧导致的脑损伤具有保护作用，海马是大脑内合成NGF的重要场所[11]。本课题组前期对局灶性脑缺血大鼠的研究发现，在海马的缺血侧出现了Nestin阳性神经元的增强表达，Nestin是神经干细胞的特征性标志物，在海马区出现神经干细胞的增殖，说明具有一定的自身代偿性修复作用。本实验观察到模型组大鼠缺血侧海马CA3区NGF的表达与正常组相比出现明显增高，而NGF的高表达则可促进Nestin的表达，有利于缺血后海马产生的神经干细胞增殖和分化。说明NGF的表达增高可促进脑缺血后大鼠的自身代偿性修复，可以在一定程度上改善神经功能缺损状况。

Gas7蛋白主要表达于脑组织，可调节神经细胞的生长分化，有报道显示Gas7的高表达对缺氧造成的神经元受损有保护作用，在慢性复合应激模型可诱导海马齿状回的神经干细胞向神经细胞分化等，从多方面参与了神经系统的损伤修复。神经系统对缺血缺氧异常敏感，尤其在大脑皮质，在缺血缺氧环境下会最先出现损伤[12]，引起细胞受损甚至凋亡。海马是大脑皮质边缘系统的一部分，属易受缺血影响的区域。既往研究表明Gas7在海马的发生和发育过程中起重要作用[13]，本研究通过免疫组化染色发现模型组海马CA3区的Gas7蛋白表达明显增高，说明缺血条件下可能激活了海马CA3区Gas7基因的转录，使Gas7在CA3区蛋白合成增多。Gas7在模型组海马CA3区的表达，提示其可能对缺血缺氧的CA3区神经元具有保护作用，促进受损神经元的修复。

有临床研究显示，针刺对改善脑梗塞患者的致残率有较好疗效，我室曾研究表明电针可通过显著增加MCAO大鼠海马CA3区Nestin和BDNF的表达诱导神经干细胞的增殖，从而对缺血后海马具有保护作用[14]。本实验对MCAO大鼠电针治疗中选取“百会”和“足三里”两穴位，“百会”归属督脉，与中枢神经系统有密切联系；“足三里”穴与血管、神经等联系密切。电针此二穴位，既可增强脑皮层兴奋性，又可对远隔部位起到明显治疗作用。实验结果发现电针可上调MCAO模型大鼠CA3区NGF和Gas7的表达，结合既往电针对脑缺血后神经系统的保护及修复作用的相关资料，NGF和Gas7的表达上调可以促进内源性神经干细胞的增殖和分化，促进神经功能的进一步修复。在本实验室前期的研究中发现电针可上调缺血侧丘脑NGF和Gas7的表达，提示电针在脑缺血后对神经系统的保护是通过多个部位神经元的调控发挥作用的，本结果可为临床上治疗脑缺血提供一定的实验依据，其分子机制有待今后进一步的研究。

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