黄芪苷Ⅳ对微囊泡损伤的大鼠胸主动脉环舒张功能的保护作用*

李烨仪，尚 曼，张琨玮，韦 苏，刘 超，祝 倩，赵俊玉，吴艳娜，宋君秋，刘艳霞

（天津医科大学基础医学院药理学系，天津300070）

微囊泡（microvesicles，MVs）是细胞在激活或凋亡等多种病理条件下分泌的直径在100～1000 nm的微小囊泡。MVs具有双层膜结构，携带来源于母细胞的多种生物活性物质，如组织因子、粘附因子、基质金属蛋白酶、DNA、RNA等，并将其转移到靶细胞中，介导一系列生物学效应。研究表明，动脉粥样硬化、急性心肌缺血等心血管系统疾病患者循环血中 MVs的水平显著升高［1，2］。在心肌缺血 ／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）损伤动物模型中，内皮细胞受损释放的MVs携带大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），在血管内皮功能障碍和心肌细胞损伤中发挥重要作用［3］。I／R损伤可以导致内皮细胞ROS过量生成，ROS累积反过来也加重内皮功能障碍。本实验室在前期研究中，采用人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）缺氧／复氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）模型模拟体内I／R损伤，成功诱导 HUVECs分泌微囊泡（H／REMVs），后者对H9c2心肌细胞产生显著的促凋亡作用［4］，并通过增强氧化应激反应抑制大鼠胸主动脉环的舒张功能［5］。

传统中药黄芪可用于治疗多种心血管系统疾病，黄芪总皂苷是黄芪的主要成分。黄芪苷Ⅳ（Astragaloside IV，AST）是从黄芪总皂苷中分离得到的主要有效成分，相对于其他成分来说，AST含量较高、水溶性较好、活性较强。研究发现，AST可以改善心脏收缩和舒张功能，松弛血管平滑肌，对缺血或缺氧损伤的心肌具有良好的保护作用［6］。本实验室前期研究表明，AST通过减少ROS产生，可减轻过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）导致的 H9c2细胞氧化应激损伤［7］。AST也可以调节内皮功能［8］。

本实验采用H／R诱导HUVECs释放的微囊泡（H／R-EMVs）处理大鼠胸主动脉环，造成其舒张功能损伤，探究AST对舒张功能的影响及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性 Wistar大鼠，体重 240～260 g，清洁级，军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）：EA.hy926，购自中国科学院细胞库。黄芪苷Ⅳ（AST，质量分数＞98%）：购自复旦大学上海医学院。BCA法蛋白质定量及NO测定试剂盒：购自碧云天生物技术有限公司。Anti-p-eNOS、Anti-p-ERK1／2及 Anti-ERK1／2：购 自Abcam公司；Anti-Akt、Anti-p-Akt及 Anti-eNOS：购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 H／R诱导 HUVECs释放 MVs

HUVECs悬液 1×105cells／ml，接种于 6孔板中，每孔2ml，5%CO2、37℃条件下培养24 h。细胞生长融合至70%～80%时，弃去培养液，每孔加入2 ml细胞缺氧培养缓冲液（NaH2PO40.9 mmol／L，NaHCO36.0 mmol／L，CaCl21.0 mmol／L，MgSO41.2 mmol／L，NaCl 98.5 mmol／L，KCl 10.0 mmol／L，HEPES 20.0 mmol／L，乳酸钠 40.0mmol／L，pH 6.2）。将培养板置于缺氧装置中（充入95%N2-5%CO2混合气体，流量20 L／min，充气15 min后密闭该装置），将缺氧装置放入37℃氮气恒温孵箱中，缺氧处理12 h。随后，将培养板置5%CO2、37℃普通培养箱中培养4 h。

1.3 H／R-EMVs的提取、蛋白质定量与透射电镜观察

H／R处理 HUVECs后，收集培养液，4℃、2 700 g离心20 min，去除细胞碎片；取上清，4℃、33 000 r／min超速离心 148 min，弃上清，沉淀即为 H／REMVs。用 D-Hank’s溶液重悬 H／R-EMVs，BCA法进行蛋白质定量，-20℃保存备用。取20μl H／R-EMVs悬液滴于载样铜网上，室温条件下放置2min，待H／R-EMVs悬液充分浸入铜网后，用滤纸吸去多余悬液。滴入2%磷钨酸染色液40μl，室温静置2 min。白炽灯照射载样铜网使之干燥后，在透射电镜放大25.0 k倍下观察 H／R-EMVs形态。

1.4 内皮完整的大鼠胸主动脉环的制备及实验分组

处死大鼠，剪开胸腔迅速取下胸主动脉，置4℃Krebs液（NaCl 118 mmol／L，KCl 4.7 mmol／L，KH2PO41.2 mmol／L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol／L，CaCl2·2H2O 2.5 mmol／L，NaHCO325 mmol／L和葡萄糖 10 mmol／L）中，剔除结缔组织后剪成3～4 mm宽的血管环，置含10%FBS的DMEM中孵育。实验分为6组：H／R-EMVs组，在孵育胸主动脉环的培养液中加入H／R-EMVs，使其终浓度为 10μg／ml；不同剂量的 AST组分别采用 10、20、40、60 mg／L AST与 10μg／ml H／R-EMVs共同孵育胸主动脉环；对照组给予等体积的D-Hank’s溶液。孵育时间为4 h，每组各测定5个血管环。各组在37℃，5%CO2条件下孵育4 h，随后将血管环悬挂于预置10ml Krebs液的浴槽中，37℃、充入95%O2-5%CO2气体，连接离体组织灌流装置和张力传感器。

1.5 离体大鼠胸主动脉环舒张功能检测

胸主动脉环在2.0 g的预负荷张力下平衡60 min。以 10-6mol／L苯肾上腺素（phenylephrine，PE）激发最大收缩，待收缩幅度稳定后，累积加入终浓度分别为 10-9～10-6mol／L的乙酰胆碱（acetylcholine，ACh），检测血管舒张功能。

1.6 大鼠胸主动脉环NO含量的测定

实验结束后，使用4℃生理盐水冲洗大鼠胸主动脉环，剪碎组织置冰上匀浆，匀浆液在4℃、12 000 r／min离心10 min。使用Griess试剂测定上清液中NO含量。

1.7 Western blot检测 p-eNOS、t-eNOS、p-Akt、t-Akt、p-ERK1／2与 ERK1／2

将大鼠胸主动脉环剪碎并匀浆，用RIPA裂解液冰上裂解，4℃、12 000 g离心10 min提取蛋白，BCA法定量蛋白质。取100μg蛋白质在10%分离胶上电泳，转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h。分别加 Anti-eNOS及 Anti-p-eNOS（1∶500），Anti-Akt及 Anti-p-Akt，Anti-ERK1／2（1∶1 000）及 Anti-p-ERK1／2（1∶2 000），4℃孵育过夜。TBST洗膜 3次，将PVDF膜与IgG抗体（1∶1 000）震荡孵育2 h。蛋白印迹通过化学发光试剂发出荧光，Quantity One软件分析条带的灰度值。

1.8 统计学处理

以均数±标准差（）来表示各组实验数据，Logit法计算不同组ACh诱发舒张的半数有效剂量及其95%的可信限（EC50±L95）。使用 SPSS 18.0对实验数据进行统计学分析，采用单因素方差分析及Bonferroni post hoc法进行组间比较。

2 结果

2.1 H／R-EMVs的蛋白定量与形态鉴定

H／R-EMVs蛋白质含量为（0.31±0.02）μg／μl。在TEM下放大 25.0 k倍，可见 H／R-EMVs呈直径0.1～1μm的膜性囊泡结构，外形为圆形或椭圆形，表面有完整的包膜，外部深染区为脂质结构，内部呈现为均一浅染区，囊泡内部未见细胞器结构（图1）。

Fig.1 Characteristics of H／R-EMVs（negative staining×25.0 k）H／R-EMVswere observed by the transmission electronmicroscope

2.2 AST对H／R-EMVs损伤的离体大鼠胸主动脉环舒张功能的影响

与对照组胸主动脉环舒张率（99.67% ±5.57%）相比，H／R-EMVs使胸主动脉环舒张率（66.07%±1.78%）显著降低（P＜0.01）。20、40和60mg／L的AST呈剂量依赖性地减轻H／R-EMVs对离体大鼠胸主动脉环舒张功能的损伤，最大舒张率分别为：73.92% ±0.61%，85.95% ±2.21%，95.51%±4.46%，与 H／R-EMVs组差异显著（P＜0.01）。10mg／L AST对离体大鼠胸主动脉环舒张功能无明显影响（64.93%±0.91%，图 2）。

比较不同组ACh诱发大鼠胸主动脉环舒张的EC50±L95，对照组（0.019±0.006）μmol／L与 H／REMVs组（0.249±0.095）μmol／L有显著差异（P＜0.01）。与 H／R-EMVs组相比，20、40和 60mg／L AST组ACh诱发舒张的 EC50±L95逐渐降低（分别为0.119±0.033，0.037±0.004，0.020±0.005μmol／L，P＜0.01），而 10mg／L AST组（0.242±0.076）μmol／L与H／R-EMVs组无明显差别。

Fig.2 Effects of AST on endothelium-dependent relaxation of thoracic aortic rings of rats impaired by 10μg／ml H／R-EMVs（，n＝5）

2.3 AST对H／R-EMVs处理的离体大鼠胸主动脉环NO含量的影响

与对照组离体大鼠胸主动脉环NO含量（84.02±5.12）μmol／L相比，H／R-EMVs组 NO含量（56.17±4.31）μmol／L显著降低（P＜0.01）。与 H／REMVs组相比，AST 20、40和 60 mg／L组 NO含量（分别为 62.11±3.91，73.37±2.99，81.91±4.15 μmol／L）显著增加，（P＜0.05，P＜0.01），并呈现出剂量依赖性相关。AST 10 mg／L组的 NO含量（54.78±3.11）μmol／L无明显改变。

2.4 AST对H／R-EMVs损伤的离体大鼠胸主动脉环 p-eNOS、t-eNOS、p-Akt、t-Akt、p-ERK 1／2 及ERK1／2的影响

与对照组相比，H／R-EMVs能够下调离体大鼠胸主动脉环 p-eNOS、p-Akt和 p-ERK1／2磷酸化水平，而不影响 t-eNOS、t-Akt和 ERK1／2的蛋白质水平。与 H／R-EMVs组相比，40 mg／L AST组对 teNOS，t-Akt和 ERK1／2无显著影响，但使 p-eNOS，p-Akt和 p-ERK1／2磷酸化水平显著上升（P＜0.01）；使 p-eNOS／t-eNOS，p-Akt／t-Akt和 p-ERK1／2／ERK1／2的比值显著增加（P＜0.01，图 3，表 1）。

Fig.3 Effects of AST on expressions of p-eNOS，t-eNOS，p-Akt，t-Akt，p-ERK1／2 and ERK1／2 in thoracic aortic rings of rats impaired by H／R-EMVs

3 讨论

EMVs与内皮功能障碍的发生和发展过程密切相关［9］。心肌梗死病人内皮功能紊乱的发生与其循环血中 EMVs数量的上升有关［1］。心肌 I／R损伤时，EMVs的大量产生可引起内皮细胞凋亡及功能障碍［10］。本研究采用体外培养的 HUVECs建立 H／R模型，模拟 I／R损伤，从而释放 H／R-EMVs。Pan等［11］实验室使用两步离心法可成功提取MVs，本实验同样采用超速离心法分离出H／R-EMVs，经透射电镜检测为直径100～1000 nm之间的囊泡结构。本实验室早期实验证实，H／R-EMVs可损伤大鼠胸主动脉环的舒张功能［5］，本实验结果同样证实该结论。

心肌I／R发生时，NO的释放减少，导致血管内皮功能紊乱［12］。NO的下调可引起心肌梗塞小鼠的血管内皮功能损伤［13］。eNOS是血管系统中NO的主要合酶。在心肌I／R损伤的病理研究中发现，通过抑制 eNOS的蛋白质水平削弱 NO的释放［14］。AST对血管内皮功能具有保护作用［6］。Chen等［15］在游离脂肪酸所致的胸主动脉内皮细胞损伤研究中发现，AST可激活eNOS，提高NO水平，恢复血管舒张，改善血管内皮功能。AST使肥胖模型大鼠离体胸主动脉环舒张率显著提高，血管内皮功能明显改善［6］。本研究表明，AST可以增加受 H／R-EMVs作用降低的大鼠胸主动脉环NO的含量，上调p-eNOS磷酸化水平，提示AST对血管内皮的保护作用可能是由于促进eNOS活化而增加NO的释放。

Akt／eNOS是介导 NO水平的经典信号途径。Akt是eNOS的上游靶蛋白，其对心肌I／R损伤的保护作用与活化Akt，促进eNOS的活化有关［16］。调节Akt信号通路，激活下游底物，上调p-eNOS磷酸化水平进而影响NO的释放，对血管内皮的正常功能起保护作用［17］。AST能够增加H／R损伤时心肌细胞Akt蛋白的磷酸化。AST通过调节p-Akt磷酸化水平发挥对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用［18］。ERK1／2是与氧化应激相关的重要信号通路。缺血预适应研究发现，在ROS诱导的心肌细胞低氧预适应模型中，通过ERK1／2途径可启动心肌缺氧预处理的保护效应［19］。本实验室早期研究发现，AST通过激活ERK1／2信号通路，可减轻H2O2引起的H9c2细胞氧化应激损伤［7］。在乳鼠心肌细胞I／R损伤与维持血管内皮功能的相关研究中均发现，AST保护作用的机制涉及 ERK1／2信号途径［20，21］。本实验结果显示，AST可使受 H／R-EMVs处理的胸主动脉环p-Akt磷酸化水平显著提高，增加 p-ERK1／2／ERK1／2比值，表明 AST对 H／R-EMVs损伤的胸主动脉环的保护作用，与调节Akt／eNOS与ERK1／2两条重要细胞信号通路相关。

Tab.1 Effects of AST on p-eNOS／t-eNOS，p-Akt／t-Akt and p-ERK1／2／ERK1／2 expressions in thoracic aortic rings of rats impaired by H／R-EMVs（，n＝5）

Tab.1 Effects of AST on p-eNOS／t-eNOS，p-Akt／t-Akt and p-ERK1／2／ERK1／2 expressions in thoracic aortic rings of rats impaired by H／R-EMVs（，n＝5）

p-eNOS：Phosphorylated endothelial NO synthase；t-eNOS：Total endothelial NO synthase；p-Akt：Phosphorylated serine／threonine kinase；t-Akt：Total serine／threonine kinase；p-ERK1／2：Phosphorylated extracellular regulated protein kinases；ERK1／2：Extracellular regulated protein kinases**P＜0.01 vs control； ＃＃P＜0.01 vs H／R-EMVs

Group p-eNOS／t-eNOS p-Akt／t-Akt p-ERK1／2／ERK1／2 Control 0.8527±0.0165 0.8180±0.0194 0.8639±0.0219 H／R-EMVs 0.4634±0.0114** 0.4086±0.0055** 0.3459±0.0139**AST 40mg／L+H／R-EMVs 0.6528±0.0185**＃＃ 0.6891±0.0188**＃＃ 0.7177±0.0582**＃＃

本实验建立体外H／R模型模拟体内I／R损伤，诱导 HUVECs产生 H／R-EMVs，研究 AST对 H／REMVs损伤的离体大鼠胸主动脉环舒张功能的作用及相关机制，首次证实20～60 mg／L AST能够剂量依赖性地改善H／R-EMVs损伤的离体大鼠胸主动脉环舒张功能，其机制涉及NO含量的增加以及peNOS，p-Akt和 p-ERK1／2磷酸化水平的提高。

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