APP／PS1双转基因小鼠的繁育、鉴定及评价*

谭 龙，李海强，李宜波，刘 伟，庞 伟，蒋与刚△

（1.军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津300050；2.天津医科大学公共卫生学院，天津300070；3.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；4.烟台高新技术开发区医院，烟台264006）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种神经退行性疾病，以进行性的记忆和行为障碍为主要临床表现，与衰老显著相关［1］。目前，用于AD研究的动物模型主要有以衰老为基础的动物模型、各种因素诱发的动物模型及转基因动物模型。自然衰老模型饲养周期及实验周期长，动物病死率高；快速衰老模型寿命短，不适合长周期实验；人工诱发模型不能完全理想地呈现出AD的典型病理特征；而AD转基因动物模型可从分子水平模拟AD的发病，可在较短时间内获得较多量的模型动物［2］。通过转基因技术建立的AD模型，主要涉及β淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、早老素 1（presenilin，PS1）、早老素 2（presenilin，PS2）、载脂蛋白 E（apolipoprotein E，APOE）、tau蛋白等基因［2，3］，通过转入不同的基因，模型动物可以稳定地表现出不同的典型特征。研究表明，转基因动物能相对较好地模拟 AD的病理学变化［4］。

本研究拟对APP／PS1双转基因小鼠进行繁育扩种，以获得满足实验需要的动物数量，并通过对小鼠脑组织病理学观察和学习记忆能力的检测，评价该模型模拟AD的效果，为该模型的应用和推广提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所王福弟教授馈赠的2对APP／PS1双转基因小鼠。

1.2 主要试剂、仪器

引物购自上海生工生物有限公司，血液／细胞／组织基因组 DNA提取试剂盒、ddH2O、2×Taq PCR Masuer Mix、Marker I、6×Loading Buffer、EB、琼脂糖、5×TBE缓冲液等均购自天根生化科技有限公司。PCR仪（美国 Bio-Rad公司），电泳仪（美国 Bio-Rad公司），WD-9403F紫外分析仪（北京市六一仪器厂），Morris水迷宫（上海欣软信息科技有限公司），Olympus-BX40生物显微镜，HMIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统（武汉同济医科大学千屏影像工程公司）。

1.3 动物饲养与繁育

繁育采用雄鼠与雌鼠1∶1合笼配对的方式。母鼠妊娠期约为20 d左右，小鼠出生20 d后根据其性别分笼饲养。

1.4 基因型鉴定

新生小鼠饲养至1月龄时剪尾进行基因鉴定。

1.5 DNA提取及定量

鼠尾消毒后，剪下2 mm长尾尖组织，使用DNA提取试剂盒提取DNA。在12μl提取的DNA样品中加入108μl ddH2O（即稀释10倍），然后分别测定260 nm和280 nm处的吸光度，260 nm处吸光度值为1时其浓度约为50μg／ml双链DNA。

1.6 PCR反应

引物序列如下：上游引物序列：5’-AGGACTGACCACTCGACCAG-3’，下 游 引 物 序 列：5’-CGGGGGTCTAGTTCTGCAT-3’，产物大小约 360 bp。采用Mix体系，反应体系25μl。PCR反应程序：94℃预变性 3 min，94℃变性 15 s，55℃退火 30 s，72℃延伸45 s，10个循环。94℃变性 15 s，55℃退火 30 s，72℃延伸45 s，25个循环。72℃延伸10min，10℃保温。

1.7 PCR产物电泳

PCR产物作1%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，当溴酚蓝电泳至距凝胶下端1／3处时停止电泳，紫外分析仪拍片分析，目的基因长度为360 bp。

1.8 Morris水迷宫实验

根据基因型鉴定结果，将携带目的基因的小鼠分入模型（AD）组，未携带目的基因的同批小鼠分入对照（CT）组。按照参考文献［5］方法稍作调整，小鼠7月龄时，各组随机选择8只小鼠进行Morris水迷宫实验，小鼠寻找平台时间为90 s，如果90 s内未找到平台，则将其引至平台并停留15 s，检测其空间学习记忆能力。

1.9 病理学观察

Morris水迷宫实验结束后，将小鼠麻醉处死，取脑组织置10%福尔马林溶液中保存。常规脱水、透明、浸蜡、包埋，脑组织连续切片，厚度5μm，裱于载玻片上，60℃烤箱烘烤1 h后备用。常规HE染色，封片，光镜下观察脑的形态学变化；同时作刚果红染色，显微镜下观察海马、脑皮层部位橘红色的点片状及近似圆形的斑块状结构，即沉积的淀粉样斑块。

1.10 统计学处理

采用SPSS 11.5进行数据整理与分析。Morris水迷宫小鼠平台潜伏时间及神经元计数以中位数M（Q1～Q3）表示，采用两组独立样本的秩和检验对数据进行统计学比较。

2 结果

2.1 APP／PS1双转基因小鼠基因型的鉴定

以从小鼠尾中提取的DNA为模板进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后将凝胶在紫外线下曝光，如目的基因在360 bp附近出现明显条带（图1），即可确定为携带APP／PS1基因的小鼠。繁育后获得同批次小鼠31只。经鉴定，携带APP／PS1基因的小鼠20只，阴性小鼠11只。小鼠编号后，随机选择（采用随机数字表法）8只APP／PS1阳性小鼠和8只阴性小鼠进行实验。

Fig.1 The genotype test for APP／PS1 transgenicmice The three bright bands on the left are the samples from APP／PS1 transgenicmice

2.2 Morris水迷宫实验

2.2.1 定向航行实验 定向航行实验共持续4 d。在此期间观察到，AD组小鼠对训练的学习和空间记忆能力较CT组差，具体表现为AD组小鼠需要花费更长时间才能到达平台，在连续训练中对寻找平台行为的巩固效果也明显劣于CT组。从实验的第2天开始，AD组小鼠需要较长时间到达平台，而实验的第3天和第4天这种表现更明显，两组差异具有统计学意义（P＜0.05，表 1）

Tab.1 The difference of the latent time in the training phase of acquisition trial between the two groups（n＝8）

定向航行实验训练阶段结束后，将平台隐匿，检测小鼠对训练的记忆能力。结果显示，AD组小鼠潜伏时间［60.0（4.7～60.0）s］较 CT组［12.3（4.6～26.7）s］明显增长，差异具有统计学意义（Z＝2.061，P＝0.039，图 2）。

2.2.2 空间探索实验 空间探索实验结果显示，在平台撤除后APP／PS1小鼠并无明显的搜索平台的行为，而是较长时间在迷宫中无目的地游动，运动轨迹未显示出小鼠在目标象限有明显的探索倾向（图2），AD组穿越目标象限区域的次数为 5（0，8），明显少于 CT组［11（4，14）］（Z＝2.430，P＝0.015）。

Fig.2 The swimming track ofmice in the probe trial

2.3 病理学检查结果

HE染色结果显示，CT组小鼠的CA1区结构正常，神经元细胞排列整齐紧密，锥体细胞核大而圆。CA3区结构正常，锥体细胞排列紧密整齐，层次清楚，细胞核呈圆形，大而规则，核仁清晰。偶见神经元细胞凋亡（图3）。而AD组小鼠海马结构及细胞形态出现明显异常，CA1区及CA3区部分神经元失去正常结构，细胞排列疏松紊乱、层数减少。锥体细胞大量丧失、数目减少，细胞联结松懈，细胞周围出现环状带，胞体缩小，细胞核出现固缩、凋亡（图3，见彩图页Ⅲ）。

刚果红染色结果显示，AD组小鼠皮层区间质可见局灶性刚果红染色阳性物质，呈小团状结构；而CT组小鼠皮层区未见刚果红染色阳性表达（图4，见彩图页Ⅲ）。

3 讨论

AD的典型病理改变为神经纤维缠结和老年斑，其中老年斑是由淀粉样蛋白 Aβ沉积引起的［6］。APPswe／PS1模型小鼠最初是由David Borchelt建立的［7］，他通过两种质粒将 Mo／HuAPP695swe和 PS1-dE9基因分别转入细胞，并分别由各自的小鼠朊蛋白启动子元件（mouse prion protein promoter elements，PrP）控制其表达。其中，Mo／HuAPP695swe基因携带有与家族性AD相关的K595N／M596L突变的人源Aβ前体蛋白，PS1-dE9基因携带有与家族性AD相关外显子9删除的人源PS1变异体，两个突变基因片段被转入同一个基因座，诱导Aβ蛋白的异常表达和代谢，导致Aβ斑块沉积［8］。因此，进行基因型检测时，目的基因为一个条带。

我们引进了APPswe／PS1双转基因小鼠杂合子种鼠4只（2雄2雌）进行繁育。由于种鼠为杂合子，根据遗传规律，其后代有1／4的概率为阴性纯合子，所以在使用前必须进行模型效果评价。为此，我们根据基因型检测结果，以同窝别阴性小鼠（阴性纯合子）作为野生型对照，对所获得的阳性AD模型小鼠进行病理学检查和行为学评价。

该模型小鼠的生长及发育规律与普通小鼠基本相似，但随着其携带的突变APP和PS1基因效应的累积，在6～7月龄时，阳性小鼠可在病理学及学习认知能力方面出现类似AD的典型特征。为评价该特征的稳定性，我们对7月龄小鼠进行病理学及行为学检测。结果表明，7月龄AD模型小鼠脑组织内出现明显的Aβ斑块沉积和神经元丢失，且Morris水迷宫实验显示该月龄的阳性小鼠学习记忆能力显著下降，与AD患者表现出类似的病理学和行为学特征，也与同类的 APP／PS1转基因小鼠模型相似［9，10］。同时，对多只该模型小鼠个体的重复实验和观察表明，该AD小鼠模型遗传性状稳定，具有较好的繁育和扩种能力，由种鼠繁育的第一代小鼠APP／PS1基因阳性率约为50%，在后续的扩种繁育过程中，当传到第三代时小鼠APP／PS1基因阳性率已达70%左右。该小鼠模型不仅在症状和体征方面较好地模拟了AD的特点，在细胞分子水平也表现出类似AD的特征，且该模型转入的突变基因位点诱发疾病进展相对较慢，发病时间也较晚，适宜用于干预时间较长的实验，这为研究AD的发病机制，探索防治AD的药物提供有力的工具。

但是，由于转基因随机整合到小鼠的基因组，外源性基因对于其自身基因组功能的发挥可能存在干扰，所以该模型小鼠普遍表现出繁殖能力降低，抗病能力差，具体表现为每胎所生小鼠数量减少，死亡率高于普通小鼠，创伤后的恢复能力减弱。在模型小鼠的繁育过程中，我们记录到AD小鼠从出生至7月龄死亡率可达25%～30%，明显高于同批次阴性小鼠（＜5%）。关注这一点对需要保种、育种以及实验周期相对较长的研究工作尤为重要。

总之，该模型小鼠较好地模拟了AD发病的病理学及行为学特征，在较稳定的年龄段出现Aβ斑块沉积，神经元丢失现象明显，学习记忆能力减退，其发病过程与人类AD病程非常相似，疾病进展速度相对较缓慢，在细胞、分子水平上也很好地模拟了AD的特点，在AD实验研究中具有较高的应用价值。虽然该模型小鼠转入外源突变致病基因后，生殖及抵抗能力出现一定程度的减弱，但这些不足可通过在饲养过程中严格控制饲养条件和环境加以改善。通过转基因技术建立的该小鼠模型，可作为研究AD发病机制及开发AD防治药物的有效实验工具。

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