骨骼肌急性钝挫伤修复过程中自噬相关因子的表达变化*

2018-06-08 01:27唐成林黄思琴赵丹丹张安宁郭全虎高睿琦
中国应用生理学杂志 2018年2期
关键词:腓肠肌骨骼肌急性

罗 翱,唐成林,黄思琴,赵丹丹,张安宁,郭全虎,高睿琦,曹 净

(重庆医科大学中医药学院,重庆400016)

骨骼肌是人体体量最大的组织,直接参与人体的各项生命活动。近年来,由于交通、体育等行业的发展,骨骼肌损伤的发病率逐年上升。90%的骨骼肌损伤属于钝挫伤或牵拉伤[1],而最常见的运动损伤中就是急性骨骼肌钝挫伤,尤其以股四头肌和腓肠肌损伤最常见[2]。骨骼肌损伤主要表现为肌纤维的断裂和肌细胞的溶解,其损伤修复时间较长,愈后较差,甚至造成骨骼肌功能和结构的不可逆损害,严重影响患者的日常生活。基于此,国内外学者对骨骼肌损伤修复相关机制进行大量的研究,但尚未得到统一观点和意见。

目前,自噬是国内外研究的热点和难点。自噬是指细胞在自噬相关基因的调控下,通过溶酶体途径降解自身衰老、变性及凋亡的细胞器和大分子物质,从而维持细胞内环境的稳定[3]。自噬既可以作为一种适应性机制,清除老化的和折叠错误的蛋白质及受损的线粒体等细胞器,也能在一定程度上促进细胞增殖和迁移[4]。实际上,自噬的过程就是细胞内容物被降解成核苷酸、氨基酸及游离脂肪酸,从而被细胞再次利用,为大分子物质的合成和ATP的产生提供必需的原材料的过程[5],通常也认为该过程是促进细胞存活的过程[6]。本课题组前期对骨骼肌损伤修复机制进行大量的研究,主要集中在炎症水平、肌卫星细胞增殖分化及细胞膜修复等方面[7-9],本实验拟通过建立大鼠骨骼肌急性钝挫伤模型,观察损伤前后不同时间点细胞自噬相关因子表达的变化,以期补充并完善骨骼肌损伤修复的相关机制,为临床治疗骨骼肌钝挫伤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年SPF级雄性SD大鼠30只,体重(200±20)g,由重庆医科大学动物实验中心提供(SCXK(渝)2012-0001)。实验动物饲养于重庆医科大学实验动物中心SPF级动物房,室内保持光照、黑暗12 h昼夜节律,室温(22±1)℃,相对湿度50%~60%,自由饮食饮水。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂:4%多聚甲醛(Biosharp生物科技公司);2.5%戊二醛(重庆医科大学电镜室);苏木精-伊红(HE)染液(北京索莱宝科技有限公司);各基因引物、逆转录试剂盒、SYBR Green、Trizol、DEPC水(Takara-宝生物工程(大连)有限公司);氯仿、异丙醇(重庆川东化工(集团)有限公司);各蛋白质一抗、各蛋白质二抗(Cell Signaling Technology(CST));抗体增强液(TOYOBO);ECL发光液(Millipore);脱脂奶粉(伊利集团)。

主要仪器:台式高压蒸汽灭菌锅、恒温孵育箱(上海精宏实验设备有限公司);生物显微镜、图像采集系统(Olympus);Hitachi-7500型透射电镜(重庆医科大学电镜室);匀浆器(IKA);低温离心机(长沙湘仪离心机有限公司);全波长酶标仪(BioTek);金属浴、温控摇床(江苏海门市其林贝尔(Qilinbeier)仪器制造有限公司);Bio-Rad标准电泳装置、实时荧光定量 PCR仪(Bio-Rad);Odyssey Fc发光仪(Gene Company Limited)。

1.3 大鼠骨骼肌急性钝挫伤模型复制

参考Kami K[10]的造模方法。自备打击器,打击器为一打击面平坦的空心铝制圆柱体(直径1 cm,长20 cm,质量20 g),底面与木制圆柱体相接(直径1 cm,长2 cm,质量2 g),木制打击面与打击部位直接接触,自制铁球640 g,从25 cm高处落下,重力6.27 N,产生动能1.57 J。造模前用小动物剃毛器剔除大鼠右小腿内侧皮肤被毛。乙醚麻醉后,将大鼠右小腿外展屈曲90°固定,打击部位为右小腿内侧面(其皮下为腓肠肌中段),抽出铁片使铁球下落导致一次性打击伤并标记。造模后通过大体观察、触诊及病理学检测,证实腓肠肌有一定收缩功能障碍且无骨折,属急性腓肠肌钝挫伤模型。重力锤的投放和大鼠的固定均由一人操作,以保证打击力度、损伤部位及程度的一致性。

1.4 分组及取材

30只SD大鼠适应性喂养一周后,随机选取6只作为对照组,对照组于造模前一天取材。其余24只大鼠制备腓肠肌急性钝挫伤模型,然后随机分为4组(n=6),各组分别在造模后 3 d、5 d、7 d、14 d取材。取材前,大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.5 ml/200 g体重)麻醉,解剖并分离大鼠右侧腓肠肌,迅速将离体的腓肠肌放在干净的滤纸上均分为3份,一份置2.5%戊二醛中固定,待做透射电镜检测;另一份置4%多聚甲醛中固定,以备石蜡包埋、冰冻切片及HE染色;第三份置液氮中速冻2 h,然后转移到-80℃冰箱保存,以备Western blot及RT-PCR检测。

1.5 腓肠肌组织HE染色及病理学评价

将各组大鼠经4%多聚甲醛固定的腓肠肌取出,自来水冲洗,酒精梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋切片并进行HE染色。光学显微镜下观察各组大鼠腓肠肌组织形态学变化,并用图像采集系统获取所需图片,进行组织学和病理学分析。

1.6 腓肠肌组织透射电镜观察及形态学评价

取经2.5%戊二醛固定的腓肠肌,使用pH 7.2的磷酸缓冲盐溶液漂洗3次,1%锇酸固定2 h,4℃下梯度酒精(50%、70%、90%,100%)脱水;置换(环氧丙烷,环氧丙烷和树脂1∶1混合液,环氧丙烷和树脂1∶4混合液,纯树脂);环氧树脂包埋后制作半薄切片(甲苯胺蓝染色-光镜下定位-定位于横切);超薄切片机切片后铜网捞片,3%醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染色法染色。待样品干燥后,透射电镜观察受损肌组织超微结构变化并进行分析。

1.7 Western blot检测自噬相关蛋白质表达水平

自-80℃取出适量腓肠肌组织,加入裂解液匀浆,离心取上清,BCA法测定蛋白质浓度,在一定量上清液中加入缓冲液后金属浴10 min,置于冰上待上样。SDS-PAGE分离蛋白质,电转移至PVDF膜,置摇床上用5%脱脂奶粉封闭1 h。轻轻冲洗PVDF膜,将其置一抗稀释液中4℃摇床上孵育过夜。次日用TBST洗膜10min×3次,加对应的二抗稀释液置摇床上室温孵育1 h,用TBST洗膜10 min×3次。将ECL化学发光液均匀涂于膜上反应2min,置发光机中曝光显影成像,以Image Studio Ver 5.0软件统计灰度值并进行分析。

1.8 RT-PCR检测自噬相关基因mRNA表达水平

自-80℃冰箱取出各组大鼠腓肠肌组织约30 mg,加入1ml Trizol试剂匀浆,依次加氯仿,振荡,离心取上清;加异丙醇,振荡,离心弃上清,75%酒精洗涤2次,晾干;加适量DEPC水溶解RNA并弹匀离心,随后测定RNA浓度。根据逆转录体系调整RNA浓度并计算逆转录所需上样量,而后逆转录合成cDNA,反应条件:37℃、15min、85℃、5 s、4℃、∞。按SYBR®Premix Ex TaqTMII(Tli RNase H Plus)配置反应混合物后,根据反应体系所需量上样并进行RTPCR扩增,上机条件:预变性(95℃、30 s);扩增(95℃、5 s,60℃、30 s);溶解曲线(95℃、5 s,60℃、1 min)。通过CFXmanager 3.1软件读取Ct值。各基因引物序列如表1。

Tab.1Primer sequences of RT-PCR

1.9 统计学处理

实验数据用均数 ±标准差)表示,采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),以LSD法进行组间两两比较。

2 结果

2.1 骨骼肌急性钝挫伤后各组大鼠组织变化情况

HE结果(图1,见彩图页Ⅰ)显示:对照组大鼠骨骼肌肌纤维呈钝角多边形,肌细胞大小结构均一,胞核大多位于细胞边缘,肌节结构完整,肌丝排列整齐(图1A)。与对照组比较,其余各组均可见大量肌纤维溶解及炎细胞浸润(图1A-E)。自然恢复3 d组,同一视野下可见少量的成肌细胞,且肿胀明显,另有大量的炎细胞浸润(图1B)。自然恢复5 d组与3 d组比较差异不大,依然存在大量的炎细胞浸润,肌纤维断裂溶解现象也较明显,肌细胞明显变形,细胞出现崩解和萎缩(图1C)。自然恢复7 d组,可见部分新生肌细胞和小血管,细胞排列相对紧密但较紊乱,其间可见明显的结缔组织填充,炎细胞浸润减轻(图1D)。自然恢复14 d组,可见肌纤维排列整齐且致密,有轻微肿胀,肌纤维大小结构均一,细胞核移至细胞边缘,损伤部位初步愈合(图1E)。

电镜观察结果(图2)显示:对照组肌原纤维无异常,肌节排列整齐,明暗带相间,线粒体横向排列于Z带附近,形态无异常,肌质网无扩张,可见明显的三联体(图2A)。自然恢复3 d组,可见线粒体明显肿胀,且结构异常,嵴变性,空泡化,肌原纤维部分溶解变形,Z线部分消失且排列紊乱,肌质网轻度扩张(图2B)。自然恢复5 d组,可见大面积的线粒体肿胀,排列紊乱,肌原纤维小灶状丢失,Z线大多消失且部分飘移,呈近似水纹状改变,肌质网扩张明显(图2C)。自然恢复7 d组,线粒体肿胀依旧明显,Z线消失或部分增粗,肌质网扩张明显,肌原纤维排列依旧紊乱(图2D)。自然恢复14 d组,可见稍清晰的Z线,形态近似于对照组,线粒体肿胀减轻、嵴疏松变性明显,线粒体排列向Z线两侧移位,肌质网扩张减轻但仍较对照组明显(图2 E)。

Fig.2 The gastrocnemius electronmicroscopy of the control group and the natural recovery group for 3 d,5 d,7 d,14 d(×20 000,scale=1μm)

2.2 骨骼肌急性钝挫伤后各组大鼠自噬相关蛋白质LC3-II、P62表达的变化

Western blot结果(表2)显示,在骨骼肌钝挫伤自然恢复 3 d、5 d、7 d、14 d过程中,LC3-II与 P62总体呈现先升高后降低的变化趋势。其中,与对照组和自然恢复14 d组比较,自然恢复3 d、5 d、7 d组LC3-II表达水平显著升高(P<0.01),3 d、7 d组也较5 d组明显升高(P<0.01)。同样,与对照组相比,在损伤后第3天 P62达到高峰(P<0.01),损伤后第5天表达开始下降但仍明显高于对照组(P<0.05),14 d组P62表达已恢复至正常水平。

Tab.2 The relative expression levels of LC3-II and P62 in gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery groups for 3 d,5 d,7 d,14 d(,n=3)

Tab.2 The relative expression levels of LC3-II and P62 in gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery groups for 3 d,5 d,7 d,14 d(,n=3)

*P<0.05,**P<0.01 vs controlgroup;##P<0.01 vs14 d;△△P<0.01 vs 5 d;▲▲P<0.01 vs 3 d

Group LC3-II P62 Con 0.376±0.126 0.260±0.067 3 d 1.195±0.064**##△△ 4.783±1.207**##5 d 0.946±0.078**## 1.560±0.392*▲▲7 d 1.284±0.115**##△△ 1.285±0.196▲▲14 d 0.351±0.076 0.788±0.289

2.3 骨骼肌急性钝挫伤后各组大鼠自噬相关基因atg7、atg10、atg12、atg16L1mRNA表达的变化

RT-PCR结果(表3)显示,骨骼肌钝挫伤在自然恢复 3 d、5 d、7 d、14 d这一过程中 atg10mRNA表达呈现先降低后升高的趋势,其中3 d、5 d、7 d组明显低于对照组与 14 d组(P<0.01)。atg7、atg12、atg16L1mRNA表达总体呈现先升高后降低的趋势,3 d、5 d、7 d各组明显高于对照组与14 d组(P<0.01,P<0.05,P<0.01);与 5 d组比较,3 d、7 d组atg7与atg12mRNA表达量明显升高(P<0.05,P<0.01);与对照组比较,自然恢复 14 d组 atg7、atg12、atg16L1mRNA表达呈下降趋势,但无统计学差异。

Tab.3 The relative expression levels of atg7,atg10,atg12 and atg16 L1in the gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery group for 3 d,5 d,7 d,14 d(,n=3)

Tab.3 The relative expression levels of atg7,atg10,atg12 and atg16 L1in the gastrocnemiusmuscle of the control group and the natural recovery group for 3 d,5 d,7 d,14 d(,n=3)

*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs 14 d;△P<0.05,△△P<0.01 vs 5 d

Group atg7 atg10 atg12 atg16L1 Con 1.003±0.093 1.007±0.149 1.002±0.082 1.010±0.182 3 d 5.117±0.380**##△ 0.276±0.112**## 3.941±1.071**##△ 2.806±0.426**##5 d 3.753±1.167**## 0.360±0.231**## 2.573±0.884*## 3.176±1.083**##7 d 6.307±0.937**##△△ 0.249±0.001**## 3.409±0.227**## 3.071±0.135**##14 d 0.626±0.100 1.268±0.202 0.674±0.028 0.715±0.107

3 讨论

起“管家机制”作用的自噬一直是国内外研究的热点及难点。目前,哺乳动物自噬的发生机制尚未完全阐明。但在酵母中已鉴定出约30多种与自噬相关的基因,同样在哺乳动物中也已鉴定出一些同源基因而且也具有一定的功能[11,12]。在生理状态下,几乎所有的细胞都存在基础水平的自噬现象,以便清除未折叠或折叠错误的蛋白质,降解大分子物质,为细胞重建、再生和修复提供必需的原材料,实现物质的循环再利用,维持细胞内环境的稳定。但在某些特殊状态下,例如缺血缺氧、氧化应激、DNA损伤,饥饿等条件下,细胞会上调自噬以清除损伤的细胞器,实现能量的再利用,抑制凋亡因子的释放,减少细胞损害[13]。

自噬的核心分子机制主要由atg相关基因及自噬微管相关蛋白1轻链3组成,在自噬级联反应数个连续步骤中起编排功能。本实验通过建立骨骼肌急性钝挫伤动物模型,检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、P62及自噬相关基因 atg7、atg10、atg12、atg16L1等指标,观察损伤后上述因子的变化情况。研究发现,与正常组比较,损伤后 3 d、5 d、7 d、14 d,atg7,atg12,atg16L1mRNA表达呈现先升高后降低的规律性变化,且变化趋势一致,atg10变化与之正好相反。atg7是具有泛素E1样酶活性的自噬相关基因,已证实Atg7是atg12-atg5泛素样蛋白通路上游的蛋白质分子,在自噬体扩张伸展中具有重要作用[14]。首先水解的Atg7通过自身被激活的507位半胱氨酸残基与Atg12的C末端甘氨酸残基结合形成高能硫酯键,催化Atg12活化,之后转运至具有泛素E2样酶活性的Atg10,再通过与Atg5连接形成异肽键,构成Atg7-Atg5系统,而后再和Atg16L1以共价键结合,组成三元复合物 Atg12-Atg5-Atg16L1[14],该复合物与前自噬泡外膜结合,促进自噬泡的伸展和延伸。因此,当细胞自噬活性增强时,Atg7、Atg12、Atg16L1表达应明显增多,Atg10应明显减少。结合上述实验结果,不难发现骨骼肌急性钝挫伤后自噬相关基因转录水平发生了改变,改变提示自噬活性明显增强,随着机体损伤的自我修复,自噬活性又逐渐降至损伤前的基础状态,提示自噬相关基因 atg7,atg10,atg12,atg16L1参与损伤的修复,推测肌肉损伤修复的速度很可能与该基因的转录水平高低密切相关。同时,研究表明Atg7也参与LC3-I的活化,促进 LC3-I与PE(phosphatidyl ethanolamine,磷脂酰乙醇胺)结合形成自噬标记分子 LC3-II。LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)是哺乳动物中Atg8的同源物,它以两种形式存在,即 LC3-I和 LC3-II,LC3-I与 PE结合成为 LC3-II,是 LC3-I的活化形式,LC3-II含量与自噬泡数量的多少成正比,当细胞内 LC3-I向LC3-II转化增加时,细胞自噬水平明显升高。因此,检测细胞内LC3-II含量变化,可以判断自噬水平的高低[15,16]。同样,由原癌基因 c-myc编码的 P62蛋白位于细胞质中,当细胞自噬时,P62与经泛素化的蛋白质结合,再与LC3-II结合形成复合物,并最终在溶酶体酶的作用下不断被降解[15]。换言之,细胞自噬水平升高时P62水平理论上应下降,而自噬活性受抑制时,P62理论上则不断累积。因此,P62同样可作为反映细胞自噬活性高低的标记蛋白质。作者采用Western blot检测损伤后不同时间点腓肠肌中LC3-II和P62水平,发现骨骼肌钝挫伤后在自然恢复 3 d、5 d、7 d、14 d过程中,LC3-II与 P62总体呈现先升高后降低的趋势,其中3 d、5 d、7 d组LC3-II水平较正常组与14 d组明显升高,14 d组恢复至正常水平。同样,与正常组对比,P62在损伤后第3天达到高峰,损伤后第5天表达开始下降,第14天恢复至正常水平,该结果也表明骨骼肌损伤修复过程中自噬活性一开始会明显增强,但随着机体自我修复,自噬活性会逐渐降至损伤前的基础状态。值得注意的是,骨骼肌损伤后LC3-II和P62两者表达并未呈现完全相反的变化,只是出现峰值的时间不一,可能系P62不仅参与细胞自噬过程,同时也参与多种生命过程,例如有研究发现P62参与细胞抗氧化应激反应中的重要通路NRF2-Keap1通路[17],同时有研究也表明P62的表达与细胞的分化有关[18]。因此需开展进一步实验,并分析P62在骨骼肌损伤中扮演的角色。

综上所述,本实验建立大鼠骨骼肌急性钝挫伤模型,通过HE染色和透射电镜对损伤后不同时间点的腓肠肌组织进行形态学观察,同时对自噬相关基因 atg7、atg10、atg12、atg16L1 mRNA表达水平及自噬相关蛋白LC3-II、P62表达水平的变化进行分析。结果直接和间接证实,骨骼肌急性钝挫伤后自噬活性显著提高,而随着损伤的修复,自噬活性又恢复至损伤前水平,提示细胞自噬参与骨骼肌损伤的修复过程,推测损伤修复的速度很可能与上述指标的表达水平密切相关,这为研究不同治疗方法对骨骼肌损伤修复的作用机制提供新思路。

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