育龄妇女叶酸代谢相关基因多态性分布研究

李晓娜,高秀叶,孙茗,赵雪杰,高航运,吕毅

(河南大学附属郑州颐和医院检验医学中心,河南 郑州 450047)

研究证实孕妇机体叶酸水平不足是导致出生缺陷的主要原因，叶酸缺乏一般由补充不足和利用能力差两方面因素引起；遗传因素会影响叶酸的利用能力，如叶酸相关代谢基因功能异常，即便按正常量补充叶酸，也会造成机体叶酸水平不足。个体遗传因素不同会导致机体对叶酸代谢能力的差异，利用基因检测技术筛查出叶酸利用能力差的高风险人群，依据检测结果合理补充叶酸，可大大降低神经管缺陷的发病风险，另外也可降低孕妇贫血、妊娠高血压、早期流产、早产等的发生风险[1-5]。

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是叶酸代谢过程中的关键酶。MTHFR和MTRR基因存在多种基因多态性位点，MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点是最常见的突变位点。这些基因多态性会影响编码酶的活性，导致血清中叶酸、维生素B12水平降低，同型半胱氨酸升高[2]。本研究旨在通过分析育龄期妇女MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G 位点多态性位点分布状况，筛查出叶酸利用能力差的高风险人群，为其合理增补叶酸提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料依据患者知情同意及河南大学附属郑州颐和医院医学伦理委员会批准，选择2015年8月至2016年8月在河南大学附属郑州颐和医院妇科门诊进行叶酸利用能力基因检测的育龄妇女作为研究对象，纳入标准为同意静脉血采集的人群，排除非郑州人群及DNA抽提不符合要求者，共计144例，年龄范围19～42岁，年龄(27.1±5.2)岁。

1.2实验方法

1.2.1DNA提取 采用乙二胺四乙酸盐(Ethylenediaminetetraacetic acidm,EDTA)抗凝管抽取受试者3 mL静脉血，用北京天根公司基因组DNA试剂盒提取DNA，TE(Tris-EDTA)缓冲液溶解，调节DNA浓度100 μg·μL-1。

1.2.2PCR扩增 MTHFR C677T的引物(北京六合华大基因科技有限公司)：正向引物FP：5-CCCCAAAGCAGAGGACTCTCTCTG-3；反向引物RP：5-CGAGGACGGTGCGGTGAGAGT-3；MTHFRA1298C的引物(华大科技)：正向引物FP：5-GCACGTCCCTCTGTCAGGAGTGTG-3;反向引物RP：5-TTGCCATGTCCACAGCATGGAG-3;MTRR A66G的引物(华大科技)：正向引物FP：5-CATGCCTTGAAGTGATGAGGAGGC-3；反向引物RP：5-ACTTGTTCTCACCCTGTG-3；反应体系含纯水8.5 μL，Ex Taq酶12.5 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，DNA模板2 μL，总反应体系25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，72 ℃ 5 min后4 ℃保存。

1.2.3对PCR产物进行Sanger测序 将测序结果与标准序列比对(北京六合华大基因科技有限公司)。

2 结果

2.1Sanger测序结果分析PCR产物经Sanger测序后，通过峰图比对可清晰的区分出该样本携带的不同基因型：野生纯合、杂合、突变纯合。经过数据综合，每个样本在MTHFR基因 C677T、A1298C和MTRR 基因A66G位点的分析数据均被获得。各种突变参见图1～3。

图1 部分样品MTHFR基因C677T结果

图2 部分样品MTHFR基因A1298C结果

图3 部分样品MTRR基因A66G结果

2.2MTHFRC677T、A1298C和MTRRA66G基因多态性分布统计144例正常育龄妇女MTHFR基因 C677T、A1298C位点的基因型分布发现，MTHFR基因C677T位点在育龄妇女中的多态性，野生纯合(CC)、杂合(CT)、纯合突变(TT)基因型频率分别为21.5%、40.3%、38.2%，C/T等位基因型频率为42.0%、58.0%；MTHFR基因A1298C位点在育龄妇女中的多态性，野生纯合(AA)、杂合(AC)、纯合突变(CC)基因型的频率分别为75.0%、22.2%、2.8%；A/C等位基因型频率为86.0%、14.0%；进一步分析发现677CT与1298AC复合突变有23例；分析144例育龄妇女MTRR A66G位点基因多态性，AA、AG、GG基因型频率分别为63.2%、31.3%、5.6%。A、G等位基因型频率为78.0%、22.0%。

假设每个位点相对独立，依据中国疾病预防控制中心叶酸利用能力的研究得出的结论，我们对MTHFR基因 C677T、A1298C、MTRR A66G三个位点进行综合风险评定，根据检测结果把个体叶酸利用能力的风险分为未发现风险、低度风险、中度风险和高度风险，指导个体实现个性化补充叶酸。

3 讨论

基因的多态性在人类基因组中非常普遍，在某些情况下，基因多态性会导致蛋白质产物的生物活性发生改变。遗传变异(多态性)在人类基因组中十分普遍，在某些情况下，可能导致蛋白质产物的生物活性改变。当MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位点发生突变，可能导致血清中叶酸、维生素B12水平的降低，及同型半胱氨酸升高等一系列改变[6]。叶酸缺乏会影响母婴健康，早期可能引起自然流产，孕中晚期引起孕妇胎盘早剥、巨幼细胞性贫血、妊娠期高血压等的发生风险，我国妇幼保健中心建议备孕妇女孕前3个月开始服用增补400 μg叶酸，增补到孕3个月一般继续增补，但随着胎儿生长发育，母体的血容量、乳房、胎盘的发育使得叶酸的需要量大增，如孕妇同时伴有叶酸相关代谢基因的突变，更易造成叶酸不足[7-8]；孕妇体内叶酸含量不足胎儿则有发生神经管畸形、唐氏综合征、唇腭裂、先心病的可能[1]。

本研究通过对育龄妇女进行MTHFR基因和MTRR基因多态性分析，发现MTHFR C677T位点CC、CT、TT基因型频率分别为21.5%、40.3%、38.2%。TT型所占比例与已知的山东潍坊41.82%[9]接近，高于西安、广西地区TT基因型频率(分别为19.9%、15.7%)[10-11]；我们认为，采样人群不同、研究地区不同都可能造成研究结果的差异。研究发现[12]，携带677TT纯合子基因型时其体内MTHFR酶活性仅为45%，1298AC杂合子基因型其体内MTHFR酶活性为68%，而(677CT+1298AC)复合杂合子基因型个体MTHFR酶活性为41%。677CT和677TT变异基因型发生较高人群的血清叶酸浓度会显著降低，同型半胱氨酸水平会升高，这些改变与巨幼细胞性贫血密切相关[13-16]。

综上所述，通过叶酸代谢相关基因多态性检测提示有部分育龄期妇女存在叶酸代谢障碍，加之妊娠3个月后不再增补叶酸，容易造成叶酸缺乏。对 MTHFR基因、MTRR基因相关位点的检测，可直接评估个体的叶酸利用能力，实现个性化增补叶酸，使体内叶酸维持在适宜水平，为今后开展优生优育保健工作提供比较有价值的医学遗传学方面的参考依据。

[1] JAMES A.GREENBERG,STACEY J.BELL,YONG GUAN，等.孕期补充叶酸：不仅仅是预防神经管缺陷[J].妇产与遗传(电子版)，2012,2(3)：53-59.DOI:10.3868/j.issn.2095-1558.2012.03.014.

[2] 侯书宁.叶酸基因多态性和唐氏综合征高危风险之间的相关性研究[J].国际检验医学杂志,2016,37(22):3120-3122.

[3] 李茜西，伍萍芝，何琳琳，等.叶酸代谢相关酶基因多态性与不良孕产发生易感性的关系[J].重庆医学，2015,44(10)：1330-1333.

[4] 安乐,焦晓辉,米娜,等.MTHFR基因多态性与非综合征性唇腭裂的相关性研究[J].中国免疫学杂志,2016,32(5):722-725.

[5] 谢晓媛,张颖,辛力,等.叶酸代谢酶MTHFR、MTRR基因多态性与原因不明复发性流产的关系[J].天津医药,2016,44(10):1243-1246.

[6] 杨灵红,白洁,王德堂,等.西安地区妊娠孕妇不同孕期血清铁蛋白、叶酸和维生素B12的水平及临床意义[J].现代生物医学进展，2014,14(6):1088-1090.

[7] 何敏，向林.重庆地区妊娠妇女早中孕期叶酸水平分析[J].检验医学与临床，2014,11(11)：2983-2984.

[8] GOMES TS,LINDNER U,TENNEKOON KH,et al.Homocysteine in small-for-gestational age and appropriate-for-gestational age preterm neonates from mothers receiving folic acid supplementation[J].Clin Chem Lab Med,2010,48(8):1157-1161.

[9] 贺宪民,张群,杨琦,等.亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶基因多态性研究[J].中国计划生育学杂志,2010,18(1):13-18.

[10] 孙文萍,万琪,苏明权.西安地区汉族亚甲基四氢叶酸还原酶的两种基因多态性[J].第四军医大学学报,2003,24(7):634-636.

[11] 沈立萍,仇小强,曾小云,等.广西健康育龄妇女亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与妊娠结局的关系[J].中国临床康复,2005,9(27):8-9.

[12] WEISBERG IS,JACQUES PF,SELHUB J,et al.The 1298A→C polymorphism in methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR):in vitro expression and association with homocysteine[J].Atherosclerosis,2001,156(2):409-415.

[13] ZAPPACOSTA B,GRAZIANO M,PERSICHILLI S,et al.5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T and A1298C polymorphisms:genotype frequency and association with homocysteine and folate levels in middle-southern Italian adults[J].Cell Biochem Funct,2014,32(1):1-4.

[14] 马国海，周峰英.776例育龄妇女不同同型半胱氨酸水平叶酸代谢关键酶基因多态性分布的调查分析[J].中国优生与遗传杂志，2015，35(8):29-31.

[15] 邢金芳,贾莉婷,荣守华,等.育龄女性叶酸代谢关键酶基因多态性与维生素B12和同型半胱氨酸关系的研究[J].中国妇幼保健,2014,29(21):3498-3501.

[16] 袁春雷,王冬娥,叶贵诚,等.叶酸代谢相关基因及血清同型半胱氨酸与出生缺陷的相关性[J].实用医学杂志,2016,32(11):1860-1863.