幽门螺杆菌通过NF-κB信号通路调控胃上皮细胞自噬及凋亡的机制研究

沈书旭

(营口市中心医院医务部，辽宁 营口 115001)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是导致慢性胃炎及胃溃疡的主要因素，胃黏膜相关的淋巴组织癌变及胃癌的发生也与其息息相关，幽门螺杆菌已成为Ⅰ类致癌因子[1-2]。我国Hp感染率约为53%，且呈上升趋势[3]，Hp感染已严重威胁着人类的健康，目前尚未发现有效的、彻底清除Hp的方法，而且关于Hp的致病机制目前还不明确，因此深入探究Hp感染机制，揭示致病机制，对于找到有效治疗Hp感染的方法具有重要意义。

自噬是机体自我保护的免疫防御机制，参与调控机体的生长、分化、发育过程及多种疾病的发生过程，对抵抗病原体感染具有重要作用[4-5]。凋亡是受基因调控的细胞程序性死亡进程，研究发现，Hp感染阳性患者中胃黏膜细胞的凋亡率显著高于感染阴性的患者[6]。细菌感染导致的自噬与凋亡可作为宿主细胞炎症发生的触发开关，但是关于Hp感染所致胃上皮细胞自噬与凋亡的机制还不清楚，本研究通过Hp体外感染人胃上皮细胞AGS，研究了Hp感染对AGS细胞自噬与凋亡的关系，并结合NF-κB特异性抑制剂SN50探讨了可能的作用机制，以期为临床预防和治疗Hp感染提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器Hp菌株购自美国ATCC；人胃上皮细胞株AGS购自中国科学院上海细胞所；F12培养基、胰蛋白酶购自美国Hyclone；胎牛血清购自美国Gibico；万古霉素(K0059)、多黏菌素(P1004)、吖啶橙(BNN2017)购自美国Sigma；Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3 ，LC3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、p65、p-p65、β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国Santa Cruz；Annexin V-FITC/PI 双染凋亡检测试剂盒购于Biouniquer Technology；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD；Sorcere Sorcere全自动菌落计数仪购自英国Sorcere；GDS7500紫外凝胶成像分析系统购自美国UVP。

1.2方法

1.2.1Hp菌株培养 自液氮罐中取出冻存的Hp菌种，迅速置于37 ℃水浴锅中轻轻震荡使其充分融化。3 000 r·min-1离心5 min后，吸取50 μL后弃去上清液，吹打混匀后划线将Hp接种至脑心浸液血琼脂平板，置于37 ℃，微需氧(10%二氧化碳、5%氧气、85%氮气)培养条件下培养48 h。挑取菌落至20 mL无菌Hp液体培养基中，置于三气培养箱的摇床上，微需氧条件，37 ℃，100 r·min-1培养24～30 h。

1.2.2胃上皮细胞AGS培养 自液氮罐中取出冻存的AGS细胞，迅速放入37 ℃水浴锅中轻轻震荡使其充分融化，转移至离心管中与F12培养基混匀后离心收集细胞沉淀，使用新鲜的细胞培养基重悬沉淀，取重悬液加入含10%胎牛血清的F12细胞培养液中，置于37 ℃，5%二氧化碳培养箱中培养。待细胞贴壁生长至皿底80%时，弃去旧培养液，磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗后，0.25%的胰蛋白酶消化并收集细胞，细胞培养液重悬后按1∶4进行传代培养。

1.2.3Hp感染AGS细胞方法 取对数生长期的AGS细胞，0.25%胰酶消化后离心收集细胞，细胞培养液重悬后显微镜下调整细胞浓度为2×105个/毫升，每孔2 mL接种于6孔板中，置于37 ℃，5%二氧化碳培养箱中培养。液体培养Hp 24 h，紫外分光光度计检测细菌浓度(1A600=1×108CFU·mL-1)。待AGS细胞生长至皿底80%时，更换新鲜培养基，并按照细菌数：细胞数=100∶1加入Hp菌悬液，置于37 ℃，5% 二氧化碳条件下共培养0 h、3 h、6 h、9 h。

1.2.4流式细胞仪检测AGS细胞自噬 分别向Hp时间梯度处理的AGS细胞、对照组AGS细胞、18 μmol·L-1SN50处理6 h的AGS细胞、18 μmol·L-1SN50+Hp共处理6 h的AGS细胞中加入终浓度为1 mg·mL-1的吖啶橙溶液，37 ℃避光孵育15 min后，0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，PBS清洗1～2次，向细胞中加入100 μL预冷的PBS溶液重悬沉淀，流式细胞仪检测阳性荧光细胞率。

1.2.5流式细胞仪检测AGS细胞凋亡 分别取Hp时间梯度处理的AGS细胞、对照组AGS细胞、18 μmol·L-1SN50处理6 h的AGS细胞、18 μmol·L-1SN50+Hp共处理6 h的AGS细胞，0.25%胰酶消化后显微镜下调整细胞浓度为2×106个/毫升，取1 mL细胞悬液离心并收集沉淀，PBS清洗2次后，加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，加入10 μL磷脂结合蛋白Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混匀，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6蛋白质印迹法检测蛋白表达 取Hp时间梯度处理的AGS细胞，0.25%胰酶消化后收集细胞沉淀，加入细胞裂解液后冰上放置30 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心20 min取上清液，BCA法检测上清中的蛋白浓度。取50 μg蛋白按照体积比4∶1加入5×上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min制备蛋白样品。蛋白上样后竖直电泳，80 V电泳30 min后，换用120 V继续电泳，直至溴酚蓝跑出玻璃板。取出蛋白胶，冰浴条件下100 V转膜，5%脱脂奶粉室温孵育6 h，分别加入相应的一抗(1∶500)4 ℃震荡培养过夜，TBST洗涤液清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗涤液清洗后加入ECL发光剂进行显影，利用自动凝胶成像系统采集图像。

2 结果

2.1Hp感染对AGS细胞自噬的影响利用吖啶橙标记Hp刺激0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS细胞，流式细胞仪检测阳性荧光细胞率分别为0 h(7.25±1.56)%、3 h(12.86±1.78)%、6 h(28.65±2.14)%、9 h(31.19±2.12)%，统计结果如图1所示。4个时间段整体比较差异有统计学意义(F=112.723,P=0.000)，Hp刺激后AGS细胞自噬率随着Hp作用时间的延长逐渐升高，Hp刺激3 h、6 h、9 h与0 h相比均差异有统计学意义(t1=3.587，P1=0.007；t2=13.683，P2=0.000；t3=15.307，P3=0.000)。

注：与0 h相比，aP<0.05

2.2Hp感染对AGS细胞凋亡的影响收集Hp刺激0、3、6、9 h的AGS细胞，流式细胞仪检测各时间点AGS细胞凋亡率分别为0 h(9.25±1.56)%、3 h(14.86±1.78)%、6 h(29.65±2.14)%、9 h(33.19±2.12)%，结果如图2所示。4个时间段整体比较差异有统计学意义(F=108.205，P=0.000)，Hp刺激后AGS细胞凋亡率随着Hp作用时间的延长逐渐增加，Hp刺激3 h、6 h、9 h与0 h相比均差异有统计学意义(t1=3.587，P1=0.007；t2=13.044，P2=0.000；t3=15.307，P3=0.000)。

注：与0 h相比，at=4.53～8.22，P=0.001～0.004

2.3Hp感染对自噬及凋亡相关蛋白表达的影响

收集Hp处理0 h、3 h、6 h、9 h的AGS细胞，提取各组细胞总蛋白，蛋白质印迹法检测各组细胞自噬及凋亡蛋白表达情况，结果如图3所示。自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ及凋亡相关蛋白Bax的表达随着Hp刺激时间的延长逐渐增高，其中Hp处理0 h、3 h、6 h、9 h时Beclin1的蛋白表达分别为(0.103±0.034)%、(0.276±0.046)%、(0.512±0.041)%、(0.579±0.036)%，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达分别为(0.179±0.084)%、(0.667±0.076)%、(2.987±0.120)%、(3.253±0.109)%,Bax蛋白表达分别为(0.127±0.014)%、(0.254±0.026)%、(0.413±0.021)%、(0.506±0.026)%，Bcl-2蛋白表达分别为0 h(0.453±0.023)%、3h(0.321±0.024)%、6 h(0.176±0.016)%、9 h(0.112±0.016)%。Hp处理3 h、6 h、9 h时Beclin1的蛋白表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达、Bax蛋白表达和Bcl-2蛋白表达分别整体比较均差异有统计学意义(F1=92.140，P1=0.000;F2=759.672,P2=0.000;F3=170.437，P3=0.000；F4=172.688，P4=0.000)。三者表达均显著高于0 h时 Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bax的蛋白表达(tBeclin1 3 h=5.361，PBeclin1 3 h=0.001；tBeclin1 6 h=12.673，PBeclin1 6 h=0.000；tBeclin1 9 h=14.750，PBeclin1 9 h=0.000；tLC3Ⅱ3 h=6.044，PtLC3Ⅱ3 h=0.000；tLC3Ⅱ6 h=34.779，PtLC3Ⅱ6 h=0.000；tLC3Ⅱ9 h=38.073，PtLC3Ⅱ9 h=0.000；tBax3 h,=6.975，PBax3 h=0.000；tBax6 h=15.708，PBax6 h=0.000；tBax9 h=20.816，PBax9 h=0.000)，而凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达随着Hp作用时间的延长逐渐降低，在3 h、6 h、9 h蛋白表达显著低于与0 h蛋白表达(tBcl-2 3 h=8.041，PBcl-2 3 h=0.000；tBcl-2 6 h=16.873，PBcl-2 6 h=0.000；tBcl-2 9 h=20.772，PBcl-2 9 h=0.000)。

注：与0 h相比，aP<0.05

2.4Hp感染对NF-κB通路蛋白表达的影响Hp作用于AGS细胞0 h、3 h、6 h、9 h后，收集各组细胞提取各组总蛋白，蛋白质印迹法检测各个时间点p65、p-p65蛋白表达变化，并进行统计，0 h、3 h、6 h、9 h四个时间段内p65和p-p65的蛋白表达分别为(0.678±0.030)%、(0.673±0.034)%、(0.664±0.037)%、(0.681±0.041)%，(0.100±0.011)%、(0.211±0.015)%、(0.387±0.026)%、(0.415±0.031)%，结果如图4所示。p65蛋白表达在0 h、3 h、6 h、9 h间差异无统计学意义(F=0.130,P=0.940)，p-p65蛋白表达在0 h、3 h、6 h、9 h蛋白表达具有明显变化，整体比较差异有统计学意义(F=134.791，P=0.000)，其中Hp作用3 h时即开始显著增高(t=6.109，P=0.000)，其表达随着Hp作用时间的延长明显增强。

注：与0 h相比，aP<0.05

2.5Hp感染联合NF-κB抑制剂对AGS细胞自噬及凋亡的影响为了检测Hp感染是否通过NF-κB信号通路促进AGS细胞自噬与凋亡，利用NF-κB通路抑制剂SN50与Hp共处理AGS细胞6 h，并检测各组细胞的自噬及凋亡情况，结果如图5所示。对照组、Hp、SN50处理后以及Hp与SN50联合处理后AGS细胞自噬与凋亡率分别为(11.76±1.70)%，(13.25±1.56)%，(28.65±2.14)%，(29.65±2.14)%，(6.56±1.40)%，(9.86±1.78)%，(19.65±2.14)%，(20.65±2.14)%，4组AGS细胞自噬与凋亡率分别整体比较差异有统计学意义(F1=79.582，P1=0.000，F2=67.421,P2=0.000)。与对照组AGS细胞自噬与凋亡相比，Hp处理AGS细胞自噬与凋亡显著增强(t1=11.054，P1=0.000;t2=10.456，P2=0.000)；SN50处理后，AGS细胞自噬与凋亡显著减弱(t1=3.403,P1=0.009;t2=2.799,P2=0.023)；Hp与SN50联合处理后，AGS细胞自噬与凋亡显著高于对照组，但低于Hp单独处理组，差异有统计学意义(t1=5.164,P1=0.001;t2=5.890,P2=0.000;t3=4.718,P3=0.002;t4=5.738，P4=0.000)。

注：与对照组相比，at=5.46～8.34，P =0.001～0.003；与Hp组相比，bt=4.23～8.56，P=0.001～0.004

3 讨论

自噬是在真核细胞中普遍存在的一种现象，依赖于溶酶体的自我消化及再循环机制，进化过程中高度保守[7]。自噬的发生起始于自噬体的形成，自噬体由细胞双层膜包裹待降解物形成，自噬体形成后与溶酶体融合后被消化降解[8]。自噬能平衡细胞合成和代谢，起到稳定细胞内环境的作用，自噬还参与调控细胞的固有免疫及获得性免疫应答过程[9-10]。

Hp感染胃上皮细胞后，细胞为了清除病原菌会诱发自噬的产生，以降解病原体及其所分泌的毒性物质，保护胃上皮细胞[11]。吖啶橙能进入溶酶体和自噬体中并能发生质子化，经吖啶橙标记的细胞无自噬溶酶体产生时呈现绿色，反之则呈现红色，流式细胞仪用于定量检测吖啶橙标记的阳性荧光细胞率，即为细胞的自噬率[12]。本研究通过吖啶橙标记Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS细胞，流式细胞仪检测自噬细胞率，结果显示，Hp刺激3 h后，AGS细胞即出现自噬现象，细胞自噬率随着Hp作用时间的延长逐渐升高，6 h时细胞自噬率达到高峰，随后开始下降，说明细胞感染Hp早期即可快速启动自噬的发生，以促进对病原菌的清除。Beclin 1蛋白参与形成自噬前体，引导与自噬相关的蛋白定位于自噬体膜上，从而促进自噬的进行，是调节自噬发生的重要因子，其表达在一定程度上反应了自噬的活性[13-14]。微管相关蛋白(microtubule associate protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)主要定位于前自噬泡及自噬泡膜的表面，参与形成自噬体，是自噬体特异性标记蛋白[15]，LC3分为Ⅰ型和Ⅱ型，自噬发生前，LC3蛋白主要以Ⅰ型状态存在，自噬发生时Ⅰ型蛋白与自噬泡膜表面的PE结合形成Ⅱ型蛋白，结合到自噬体膜上[16]。本研究结果显示噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ的表达逐渐随着Hp刺激时间的延长逐渐增高，LC3Ⅰ蛋白表达随着Hp作用时间的延长逐渐降低，Hp处理6 h对蛋白表达作用效果最显著。说明Hp感染AGS细胞后促进了自噬的发生。

细胞凋亡是细胞受基因调控的主动性死亡过程，机体通过凋亡清除掉机体内衰老及畸形细胞[17]。Hp感染胃上皮细胞后，会诱使凋亡的产生以清除病变细胞。利用Annexin V-FITC/PI双染色标记Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h细胞，流式细胞仪检测凋亡细胞，结果显示，Hp感染3h细胞凋亡率出现显著增加，6 h时凋亡率变化最显著。Bcl-2家族是调节细胞凋亡的关键原件，其家族成员Bcl-2和Bax与细胞凋亡密切相关。Bcl-2蛋白可能通过阻断细胞程序性死亡的一个早期环节阻遏细胞凋亡。Bax蛋白在细胞中通过与Bcl-2蛋白形成二聚体，使Bcl-2蛋白失活，从而调控细胞凋亡[18]。本研究结果显示，Hp感染3 h后Bax的表达显著增加，6 h时变化最显著，Bcl-2蛋白表达则随着Hp作用时间的延长逐渐降低。说明Hp感染AGS细胞后促进了凋亡的发生。

NF-κB信号通路广泛参与机体的感染、免疫及凋亡进程，被认为在慢性炎症转变为癌症的进程中具有重要作用[19]。在未受到刺激时，NF-κB二聚体p50/p65与其抑制蛋白IκBα形成多聚体，处于失活状态，细胞受到病原菌感染等刺激时，IKK活化，使IκBα发生磷酸化，无活性的多聚体降解，暴露出NF-κB二聚体的核定位序列，二聚体进入核内，与靶蛋白结合，促进下游基因的表达[20]。检测Hp感染对NF-κB信号通路蛋白的影响，发现Hp感染能显著促进p-p65蛋白的表达，且随着刺激时间的延长蛋白表达也随之增强。说明Hp感染能影响NF-κB信号通路蛋白的表达，为了进一步验证Hp感染是否通过NF-κB信号通路调控AGS细胞的自噬与凋亡，本研究利用NF-κB抑制剂SN50与Hp共同作用于AGS细胞，检测AGS细胞的凋亡与自噬的发生；结果发现，与对照组相比，Hp处理AGS细胞自噬与凋亡显著增强；SN50处理后，AGS细胞自噬与凋亡显著减弱；Hp与SN50联合处理后，AGS细胞自噬与凋亡显著高于对照组，但低于Hp单独处理组，说明Hp感染导致的AGS细胞自噬与凋亡的增强与NF-κB通路的活化有关。

综上所述，Hp感染促进胃上皮细胞AGS的自噬与凋亡的发生，其作用机制与NF-κB通路的活化有关，上述结果可能为临床开发新的预防与治疗Hp感染的药物提供理论依据。

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