抗CD3-EGFR双特异性抗体标记DC-CIK免疫细胞的制备及其临床安全性研究

吴中杰 胡奕 张雁飞 苗瀛 吴滌樊 徐荻★

近年来我国恶性肿瘤发病率和病死率持续走高［1］，DC- CIK细胞是从人外周血单个核细胞（PBMC）通过IL-2﹑GM-CSF﹑IL-4等细胞因子诱导扩增出树突状细胞（DC），并与CIK细胞共培养获得的对肿瘤细胞具有非特异性杀伤活性的免疫细胞［2］。CIK是一群异质T细胞，其杀肿瘤效应细胞为同时表达T细胞CD3和NK细胞CD56表型的NK样T淋巴细胞，具有NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点［3-4］。研究表明［5-7］，表皮生长因子受体（EGFR）对肿瘤的发生﹑发展﹑侵袭﹑转移﹑复发﹑分期有重要意义并可用作指导分子靶向治疗的标志物。在体外将抗CD3单克隆抗体与抗EGFR单克隆抗体偶联成对CD3 分子和EGFR具有双重结合活性的双特异性抗体，并对其体外抗肿瘤活性和对晚期肺癌患者的临床治疗安全性进行了观察，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 抗CD3单克隆抗体购自TONBO生物科学公司（OKT3克隆），人源化抗EGFR单克隆抗体（cetuximab）购自美国默克公司，蛋白交联试剂Traut's reagent和Sulfo-SMCC购自美国赛默飞世尔科技公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天公司，抗CD3﹑抗CD56﹑抗CD4﹑抗CD8﹑抗TgG等流式抗体均购自美国BD公司，肺癌A549肿瘤细胞购自中科院细胞保藏中心，CCK8购自同仁化学研究所。

1.2 方法 （1）抗CD3-EGFR双特异性抗体的偶联和纯化：根据美国赛默飞世尔科技公司蛋白交联试剂方法用Traut's reagent和Sulfo-SMCC试剂偶联抗CD3单克隆抗体和抗EGFR单克隆抗体，偶联产物用琼葡糖凝胶柱（superose 6）进行纯化，获得纯度＞90%的二聚体，即为抗CD3-EGFR双特异性抗体。（2）DCCIK细胞制备及检测：采集患者外周血50ml，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出PBMC，取PBMC接种至GT551无血清培养液，调整细胞浓度为1×106/ml， 添 加 IFN-γ（1000U/ml）﹑IL-2（500U/ml）﹑ 抗CD3 单抗（20ng/ml）﹑IL-4（1000U/ml）﹑GM-CSF（500U/ml），在37℃﹑5%CO2条件下培养，5d后即可诱导出未成熟DC细胞，加入TNF-α（500U/ml）使DC成熟。7d后加入含IL-2（500U/ml）的培养液隔天传代培养7～10d，即得DC-CIK细胞，收集细胞（专利技术：201310102720.4）。将培养14d的DC-CIK细胞与荧光标记抗人CD分子单抗孵育，再通过流式细胞分析测试免疫效应细胞CD3﹑CD56﹑CD4﹑CD8的阳性百分率。（3）DC-CIK细胞对肿瘤A549肿瘤细胞的杀伤实验：将A549细胞接种于96孔板（每孔20000个/100μl），接种4h后加入对应数量的DC-CIK细胞，共培养过夜（约16～18h），用PBS洗板后加入CCK8用酶标仪进行细胞活性检测。（4）抗CD3-EGFR双特异性抗体标记DC-CIK免疫细胞制备：将诱导扩增后达到质量标准的DC-CIK细胞离心去除培养基，用无血清培养基洗涤一遍，加入合适剂量的双特异性抗体37℃孵育30min后，用医用生理盐水注射液洗涤2次，并取样检测对肿瘤A549细胞的杀伤活性。细胞最后用医用生理盐水悬浮并加入人血清白蛋白至2%浓度制成注射悬液。DC-CIK细胞的质量标准：①细胞数量＞1×109/100ml；②T细胞数量（CD3+）＞90%；③NK样T细胞数量（CD3+CD56+）＞30%；④对EGFR阳性肿瘤细胞杀伤活性（效靶比 10：1）＞50%；⑤细胞存活率测定＞90%；⑥细胞内毒素＜0.5EU/ml。此外细胞需进行细菌检测﹑真菌检测﹑放线菌检测﹑革兰氏阳性菌阴性菌检测和支原体检测，应符合规定。（5）临床部分：通过将检验合格的抗CD3-EGFR双特异性抗体标记的DC-CIK免疫细胞回输患者，观察输注过程中及输注后反应，评估其临床安全性，同时回输治疗前后通过KPS评分及影像学检查﹑实验室检验的比较，评估其疗效。

2 结果

2.1 CD3-EGFR双特异性抗体的制备和鉴定 用Traut's reagent和Sulfo-SMCC试剂偶联抗CD3抗体和抗EGFR单抗，偶联产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，拍照进行灰度扫描（灰度扫描仪：CLINX Science Instrument，Gel documentation system），分子量在300KDa左右的单克隆抗体二聚体含量＞20%，见图1。偶联产物进行琼葡糖凝胶柱纯化，收集不同波段样品并进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集双特异性抗体的纯度，见图2；将纯度最高的27﹑28﹑29﹑30号样品合并，BCA试剂盒检测蛋白浓度，无菌过滤储存以备细胞标记所用。

2.2 抗CD3-EGFR双特异性抗体标记DC-CIK细胞前后对肿瘤细胞的杀伤活性 从外周血分离PBMC诱导DC-CIK细胞对A549肿瘤细胞的杀伤活性在10：1的效靶比前提下，质量标准为达到杀伤率＞50%。图3中3例患者普通DC-CIK细胞的杀伤活性分别为51.8%﹑50.3%﹑51.6%；用抗CD3-EGFR双特异性抗体标记后DC-CIK细胞的杀伤活性显著提升，3例患者的DCCIK细胞经双特异性抗体标记后对肿瘤细胞的杀伤活性达到82.0%﹑81.3%和96.1%。

图1 双特异性抗体偶联前后电泳图

图2 偶联产物分子筛纯化前后非变性聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳图。（样品27、28、29、30灰度扫描纯度＞90%）

图3 双特异性标记前后DC-CIK细胞对肺癌A549细胞（EGFR阳性）的杀伤率，免疫细胞与肿瘤细胞的效靶比为10：1

2.3 临床安全性观察及研究 在本次研究中，对15例晚期肺癌患者进行了48人次的回输治疗，其中有3人次在输注时出现发热，体温37.5℃～38.4℃，予对症用药后体温恢复正常，无恶心呕吐﹑腹痛腹泻﹑皮肤瘙痒﹑皮疹等其他不良反应。治疗期间，影像学检查及实验室检验未见患者出现明显肿瘤转移复发，同时KPS评分15例病例中有11例KPS评分有10～20分的提高，4例评分未改变，无评分下降病例。

3 讨论

研究证明固有免疫系统的NK细胞可以识别并杀伤对化疗和放疗均不敏感的肿瘤干细胞，因此，NK细胞﹑NK样T细胞的非特异性细胞免疫治疗技术在肿瘤的综合治疗中起到更重要的作用。但是NK类细胞治疗依然存在靶向性不能覆盖所有肿瘤细胞的问题。NK细胞通过识别靶细胞NKG2D配体而诱发杀伤活性，突变的肿瘤细胞MHC classⅠ表达下调，NKG2D配体增加，从而诱发NK细胞的非特异杀伤活性，但是有些肿瘤细胞通过胞外小体分泌大量的可溶性NKG2D配体，或在免疫压力下以其它方式改变细胞表面的分子表达，逃避非特异免疫细胞的攻击。因此以NK样T细胞为效应细胞的DC-CIK细胞临床治疗效果仍有限。

作者将抗CD3单克隆抗体与抗EGFR单克隆抗体偶联成对CD3 分子和EGFR具有双重结合活性的双特异性抗体，并将其与DC-CIK细胞孵育，由于DCCIK细胞大部分为表达CD3分子的T淋巴细胞，抗CD3-EGFR双特异性抗体通过与CD3抗原结合，将抗EGFR抗体标记至DC-CIK细胞表面，使DC-CIK细胞对EGFR高表达肿瘤细胞具有靶向性，从而显著提高DC-CIK细胞对表达EGFR肿瘤的杀伤活性。体外效靶细胞共培养实验结果证明杀伤活性提高了近1倍。相比其他的细胞免疫治疗，该技术具有更好的靶向性，能起到更好的治疗疗效，为细胞免疫治疗提供了一种新的方法。

偶联于DC-CIK细胞上的抗体，在临床单独使用时剂量每次在几百毫克以上，毒副作用较大，而用于偶联标记DC-CIK上的抗体剂量仅为数毫克，剂量相比非常微小，因此，作者推测用此双特异性抗体标记的DC-CIK细胞在体内有较好的安全性。结合临床观察，输注过程中仅有轻微发热，无明显其他不良反应，所以提示具有较好的安全性。目前观察经过输注，治疗期间肿瘤稳定，未见明显进展，但临床远期疗效有待进一步追踪随访。

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