论样品与标准品体系的差异对实验结果的影响

◎ 刘 猛

（辽宁省产品质量监督检验院，辽宁 沈阳 110144）

溶剂效应是指当样品中某些组分在溶解溶剂与流动相中存在的差异较大导致的色谱行为异常的情况，因此在用液相色谱检测时，通常会选择初始比例的流动相来溶解样品，其目的是避免溶剂效应引起的峰型变差带来的定量不准确等后果，这一点对于大多数样品非常适用。但定量是以定性为前提的，因此除了溶剂体系的差异所引起的溶剂效应外，样品本身与标准品的pH值的差异在定性时带来的影响也是不容忽视的。本文描述了在使用高效液相色谱仪检测市售浓缩冷面汤中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠时，如何解决样品中目标物保留时间漂移引起的无法准确定性，进而无法出具定量报告的问题。

1 材料及方法

1.1 仪器及试剂

1.1.1 仪器

美国PerkinElmer公司Altus A-30 超高效液相色谱仪，配有PDA检测器，柱温箱，自动进样器和Empower软件；色谱柱：C182.1 mm×50 mm，1.7 µm；Eppendorf移液枪；pH计，梅特勒。

1.1.2 试剂

甲醇：色谱纯，Fisher公司；乙酸铵：色谱纯，TCI公司；超纯水：密理博；安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准品：1.0 mg/mL，国家标准物质研究中心GBW；25%氨水：优级纯，Merck。

1.1.3 标准溶液配制

用纯水配制含苯甲酸、山梨酸、糖精钠安赛蜜浓度为1 µg/mL的混合标准溶液。

1.1.4 实际样品

市售袋装浓缩冷面汤。实验中，样品加标终浓度均为 1 µg/mL。

1.2 试验方法

1.2.1 仪器方法

流动相A：甲醇，流动相B：20 mmol/L乙酸铵，按A∶B=5∶95比例等度洗脱[1]；柱流速0.45 mL/min；进样量10 µL；柱温，室温；PDA检测波长230 nm[1]，采样频率20 point/s。

1.2.2 样品处理

冷面汤样品用纯水稀释10倍上机检测。

2 结果与讨论

2.1 实验中出现的问题

用1.2.1方法进行检测，标准品峰型及分离效果均正常，如图1所示，按出峰前后顺序，分别为安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠。

图1 四种标准品色谱图

上机检测1.2.2得到的实际样品，结果如图2所示。图2中，上方的线为冷面汤样品，下方的线为用1.2.1中流动相配制的混标，将标准品与实际样品谱图进行了对比，通过保留时间判断，初步判定冷面汤样品中没有待测的4种添加剂。为了进一步验证结果，向冷面汤中添加标样后再上机检测，结果如图3所示。

图2 实际样品与标准品对比图

图3 实际样品与样品加标对比图

图3中，上方的线为样品，下方的线为加标样品，在冷面汤样品中山梨酸和糖精钠，由标准体系中的2.5 min后出峰，提前到2.4 min前出峰，并且两个峰分离度变差，达不到基线分离。在对比了冷面汤样品和样品加标后的谱图不难发现，在实际样品中是存在糖精钠的。但由于糖精钠在标准品和冷面汤样品中出峰时间相差较大，无法通过软件定量分析。因此糖精钠在不同体系中保留时间匹配不上及其与山梨酸分不开的问题亟待解决。

2.2 解决措施

首先在检测冷面汤样品时调整了仪器检测条件，如降低柱流速、更改检测波长、采样频率、降低甲醇比例至2%，这些条件的更改对于样品中山梨酸和糖精钠的分离没有起到改善作用。由此分析，在检测实际样品才会出现问题，初步判断是样品自身和标准品的差异过大所导致，接下来测量样品和配制好的标准品溶液pH值。结果显示，标准品溶液pH值为6.7，而冷面汤样品的pH值仅为2.8。为了确认是pH值引起的样品中目标峰漂移，对制样的过程尝试调整。

在稀释样品前，先用氨水调节样品pH值至6.7±0.1，调整流动相比例为甲醇∶乙酸铵（7∶93，V/V）将样品稀释10倍[2]，最后加标上机检测。但1.2.1中的等度洗脱条件仍然无法将山梨酸和糖精钠分离开，于是又尝试用梯度洗脱进行分离。经过优化，最终确定仪器条件为柱流速0.2 mL/min，进样量2 µL；柱温，室温；PDA检测波长230 nm，采样频率20 point/s，梯度洗脱条件表见表1。

表1 梯度洗脱条件表

经过优化后，加标样品中的山梨酸和糖精钠可以达到基线分离，见图4。将加标的样品和未加标样品、以及流动相配制的标准品进行比较，4种目标物在任何体系中保留时间都未漂移（见图5），可以定性定量分析。

图4 优化后的样品加标色谱图

图5 对比图

3 结论

通过实验可以看出，溶剂效应不仅仅局限于目标物在不同溶剂体系中溶解度不同引起的峰型变差，还体现在酸碱度不同引起的目标物电离状态的不同而引起的峰漂移。因此，对于液相色谱分析而言，保留时间的匹配是准确定量的前提，尽可能地保证样品稀释剂体系与流动相体系相同，才能避免溶剂效应所引起的各种色谱行为异常的现象，为准确定量提供保障。

[1]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.GB 5009.28-2016 食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定[S].北京：中国标准出版社，2017.

[2]刘 丽，彭名军，郑志伟，等.UPLC法同时测定食品中5种添加剂[J].现代预防医学，2010，37（12）：2318-2319.