绿豆发芽富集GABA及产品开发研究进展

马玉玲 罗可大 佟立涛 王丽丽 周闲容 刘兴训 周素梅

(中国农业科学院农产品加工研究所1，北京 100193) (浏阳河集团股份有限公司2，长沙 410000)

绿豆是豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionoideae)菜豆族(Phaseoleae)豇豆属(Vigna)中的一个栽培豆种，学名Vignaradiata(L.) Wilclzek，英文名Mung bean，Green bean，又叫植豆、菉豆、青小豆等。绿豆在中国已有2 000多年的栽培历史，是我国主要食用豆类作物，主产区集中在华北及黄河、淮河流域的平原地区，以吉林、内蒙古、河南等省最多，新疆、重庆、四川等地次之，常年种植面积约80万公顷，总产量近100万t[1-2]。据《本草纲目》等记载，绿豆甘、寒、无毒，具有清热去暑、解毒、泻火、明目等保健功效，是传统的药食同源作物之一。近些年来的研究发现，绿豆不仅具有高蛋白、中淀粉、低脂肪、富含多种维生素和矿物质等特性，还含有多酚、黄酮、GABA、D-手性肌醇(DCI)、牡荆素、异牡荆素、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)等功能性成分，具有解毒、改善肠道菌丛、降血脂、抗氧化、抗菌、抗肿瘤、提高免疫力等多种生理功能特性[3]。

GABA又称氨酪酸，是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于动物、植物及微生物中，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质[4]，具有降血压、促进睡眠、增强记忆、抗焦虑、预防和治疗癫痫、解毒等多种生理功能[5]。Takeshima等[6]通过动物毒性实验证实GABA作为一种潜在的功能性食品原料是安全的。我国卫生部2009年第12号公告，根据《食品安全法》和《新资源食品管理办法》的规定，批准GABA为新资源食品[7]。尽管GABA对人体健康具有重要的作用，但随着年龄的增长和压力的增大，人体内的GABA生成量日益降低。因此，从食物中补充GABA对人体健康具有重要意义。然而，高等植物组织中天然存在的GABA的水平较低(0.03～6 μmol/g)，再加上加工损失[8-9]等，其GABA含量不能满足人体生理需要。

随着科研工作者对GABA富集研究的深入，发现糙米[10]、大麦[11]、苦荞[12]等经发芽处理，能有效地富集功效成分GABA，富GABA食品开发一时成为功能食品研究的热点，但目前市场上富含GABA产品主要来源于发芽糙米，不足以满足广大消费者广泛的需求。因此，有必要研究开发其他富含GABA的产品。研究显示，绿豆含有丰富的蛋白质，且产生GABA的底物谷氨酸含量很高[13]。因此，绿豆可作为富集GABA的良好来源[14]。然而，GABA的富集受富集条件，如温度、湿度、金属离子浓度、酶活性等因素影响很大[5, 11]。因此，加强对绿豆GABA富集条件的研究，对于成功开发具有特定生理功能特性的富GABA绿豆产品具有重要的意义。

本文通过对绿豆的基本营养功能物质、GABA的产生机理与影响因素及富含GABA绿豆产品开发等的总结，希望能对绿豆功能性产品研究提供参考。

1 绿豆的营养及功能特性概况

绿豆不仅各营养素种类齐全，而且富含多种功能性成分，具有多种生理功能特性。

绿豆淀粉质量分数为40.60%～54.59%，淀粉颗粒呈圆形或椭圆，形粒径大小范围10.50～27.59 μm[15]。绿豆淀粉中直链淀粉质量分数为12.50%～39.80%，抗性淀粉质量分数为16.10%～22.30%[16]。抗性淀粉不能在小肠中消化吸收，但能够在大肠中被发酵，改善肠道微生物群组成，具有很好的益生作用[17]。绿豆蛋白质量分数18.00%～33.10%[16]，比禾谷类高1～3倍，是良好的植物蛋白来源。绿豆蛋白所含氨基酸种类齐全，且赖氨酸丰富[18]，高于一般禾谷类粮食，但缺乏含硫氨基酸[19]，建议与含硫氨基酸丰富的食物同食。绿豆脂肪含量较低，在0.11%～1.90%之间，且棕榈酸、亚油酸和亚麻酸是其主要脂肪酸，总不饱和脂肪酸相对质量分数为61.82%[16, 20]。绿豆中膳食纤维含量丰富，且主要来源于绿豆皮，其质量分数为6.40%～15.49%[21-22]。丰富的膳食纤维使得绿豆具有良好的润肠通便、平衡肠道菌丛、抗癌、降血糖、降血胆固醇、预防心血管疾病等多种功能特性[23]。绿豆中也含有多种人体所需的维生素和矿物质[24]。此外，绿豆中还含有多酚、黄酮[16]、GABA[25]等植物化学物质[24, 26-27]，具有抗氧化、降血脂等多种生理功能特性，适当食用，有助于改善人体健康。

2 GABA植物富集法产生机制

GABA是动植物抑制性神经传达不可缺少的物质，我国于2009年批准GABA为新资源食品[7]。近些年来，随着GABA及富含GABA产品降血压、降血脂[28-29]、降胆固醇[30]、抗癌[31]、抗焦虑、改善睡眠、提高记忆等生理活性的发现[32-33]，越来越多的科研工作者对于如何提高植物GABA含量、开发富含GABA的产品产生了很大的兴趣。

目前，产生GABA的方法主要有化学合成法、微生物发酵法和植物富集法。化学合成法是指利用化学物质直接反应合成GABA；微生物发酵法是指利用一些体内含有谷氨酸脱羧酶的微生物生产GABA；植物富集法是指利用逆境胁迫条件下植物的应激反应生成GABA。由于化学合成法和微生物发酵法均存在一定的安全隐患，所得产品难以在食品中应用。因此，植物富集法产生GABA受到了国内外食品研究者的高度关注。

高等植物富集产生GABA的机制主要是由GABA支路和多胺(Polyamines, PAS)降解途径合成[32, 34-36, 37](图1)。

图1 高等植物GABA富集与代谢途径[38]

Tokunage等[39]追踪[14C]-GABA代谢路径，最先发现并证实了植物体内存在GABA支路，并说明了GABA可通过TCA循环氧化分解[40-41]。此后，大量研究显示[32, 34-35]，GABA支路为L-谷氨酸(L-Glutamic Acid,L-Glu)在限速酶谷氨酸脱羧酶(Glutamate Decarboxylase, GAD)的催化下脱羧形成GABA，再经GABA转氨酶(GABA, Transaminase, GABA-T)可逆催化形成琥珀酸半醛(Succinic Semialdehyde, SSA)，随后琥珀酸半醛脱氢酶(Succinic Semialdehyde Dehydrogenase, SSADH)将SSA不可逆氧化生成琥珀酸并进入三羧酸(Tricarboxylic Acid, TCA)循环代谢。值得注意的是植物中的限速酶GAD存在钙调素结合域，适量的Ca2+/CaM可激活GAD。当植物受到冷激、热激、渗透胁迫、机械损伤等，细胞中Ca2+浓度会急剧增加，从而增强GAD活性，积累GABA[42]。此外，研究证实磷酸吡多醛(PLP)不仅是GAD的辅酶，也是GABA-T的辅酶[34]。因此，GAD和GABA-T活性亦受到PLP的影响。

Yang等[36]和Xing等[37]研究发现，发芽蚕豆和发芽大豆中多胺降解途径对于GABA富集的贡献率分别高达30%和39%，多胺降解途径积累GABA才逐渐被认识并重视起来。此后，大量研究显示，多胺降解途径即为二胺(Put)或多胺(Spm和Spd)分别经二胺氧化酶(Diamine Oxidases, DAO)和多胺氧化酶(Polyamine Oxidases, PAO)催化生成4-氨基丁醛，再经氨基醛脱氢酶(Aminoaldehyde Dehydrogenase, AMADH)脱氢生成GABA，与GABA支路交会后在GABA-T及SSADH催化下进入TCA循环氧化分解[43]。

表1 不同发芽条件对绿豆GABA含量的影响

通过对GABA产生机制的探究可知，GABA的产生与L-Glu、Put、Spd和Spm等底物浓度，GAD、GABA-T、SSADH、DAO、PAO、AMADH等酶活性密切相关，且不同植物GABA代谢相关酶的组成、特性等不同[44]。在实际生产加工富集过程中，特定植物会因加工条件如温度、pH、金属离子、盐离子、氧浓度等不同而直接或者间接影响底物浓度和酶活性，从而影响GABA富集效果。因此，研究绿豆GABA的产生机制，探究不同加工条件对GABA富集的影响，对于指导植物GABA富集具有重要作用。

3 绿豆发芽富集GABA的影响因素

已报道的粮谷类通过发芽富集GABA的有糙米、大麦、小米、大豆、粟谷、绿豆、蚕豆、豇豆等[8, 11, 14, 36, 39]。绿豆作为一种粮食作物，本身非常安全，而且具备易储存、发芽周期短、酶活力高等优点，可用来富集生产GABA。然而，不同的植物富集法的条件对绿豆GABA的富集有很大影响，表1对不同处理条件对发芽绿豆GABA含量的影响进行了总结。

综合不同处理条件对发芽绿豆GABA含量的影响可以发现，绿豆发芽富集GABA量的高低与水分、温度、时间、促生因子等密切相关。

3.1 水分

浸泡或者淋水都有助于增加绿豆水分含量，使绿豆水分保持在一定范围内，激活绿豆代谢酶系，增加GABA含量。但淋水时间间隔太短，供水充足，一方面会引起氧气浓度下降，不利于发芽的正常进行[50]；另一方面过多的水分会引起水溶性物质的流失，营养品质下降，也不利于发芽[51]。尹涛等[51]研究发现，随着淋水间隔时间的增加(0～4 h/次)，GABA含量呈交替性变化，且淋水频率为3 h/次时，每次喷淋1 min，GABA含量达到最大。

3.2 温度

研究显示，一般情况下，随着浸泡温度(20～40 ℃)、发芽温度(20～35 ℃)的增加，绿豆芽中GABA含量均显著增加，但浸泡温度和发芽温度太高或太低都不利于GABA的积累[46, 51]。这主要是因为随着发芽温度在一定范围内的升高，芽体内的酶活力增加，呼吸作用加强，物质分解、转换和运输速率快，有助于加快GABA的积累[52]。然而，也有研究显示，经历低温处理(0～-5 ℃处理2～4 h)，能引起细胞质中Ca2+浓度上升，激活GAD，从而引起GABA的积累[53]。陈振等[54]研究显示，不同品种的芽用绿豆烫种处理后随着萌发时间的增加，GAD活性不断减小，GABA含量均较低(<18.300 mg/100 g)，且有持续减小的趋势。而Jeon等[55]研究显示，糙米发芽浸泡前经历热处理(40和45 ℃)，有利于GABA的积累。这可能是因为陈振等[54]实验所用芽用绿豆不适合富集GABA，或者绿豆经烫温度过高，GABA代谢酶被破坏所致。

3.3 时间

大量研究显示，随着绿豆浸泡时间/发芽时间的延长，GABA含量呈现先增加后降低的趋势，且不同文献报道的最佳浸泡时间和发芽时间差别较大[8-9, 45-46, 57]。这是因为浸泡吸水过程中，GABA合成相关酶被激活，胚内干物质从凝胶状态转变为溶胶物质，胚乳中的干物质转化为可溶性物质，绿豆的物质代谢速率加快，有利于谷氨酸脱羧酶的合成[56]，并随着发芽时间的增加，内源酶被激活，蛋白质水解使得作为底物的L-Glu含量增多，从而使GABA含量增加。但过长的浸泡时间会使得绿豆吸水过多，绿豆本身的细胞结构被破坏，代谢降低，使GABA的合成减少[45]；而且随着绿豆发芽时间的延长，绿豆中GABA含量的升高，谷氨酸的脱羧反应受到抑制，或由于GABA与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，从而使GABA含量降低[57]。

3.4 促生因子

发芽过程中除了提供必要的水分、温度、发芽时间，适当添加单一或复合促生因子也直接或间接影响绿豆的发芽效果及GABA富集量。这些促生因子包括各类盐离子，如CaCl2、NaCl；维生素，如VC、VB6；GABA代谢底物等，如MSG、L-Glu。左娜等[46]通过在发芽绿豆培养液中添加CaCl2发现，随着钙离子浓度(0～2.5 mmol/L)的升高，GABA含量增加，且当Ca2+浓度达到2.5 mmol/L时，GABA含量达到最大值0.139 8 mg/g。宁初光等[57]研究发现，当发芽绿豆浸泡液中Ca2+浓度在0.3 mol/L以内时，能促进发芽绿豆GABA的积累，且当Ca2+浓度为0.1 mmol/L，GABA的含量最高(282 mg/100 g)，比空白对照样品高出13.2%，而过高的Ca2+浓度处理，绿豆芽中GABA含量反而下降。Yang等[58]研究显示，蚕豆经历NaCl胁迫处理有助于GABA的富集。研究显示[46, 57, 59]，随着VC、L-Glu及MSG添加量的增加，溶液中H+浓度增加，有利于L-Glu脱羧，而不利于GABA转氨，从而利于GABA的积累，但过高的浓度会使培养液中离子浓度升高，细胞外渗透压高，引起物质运输通道的堵塞，影响GAD活性，不利于GABA合成。

3.6 其他

此外，其他粮食及豆类，如发芽糙米、发芽豆类等富集GABA的例子还显示，机械损伤、低氧胁迫[36, 60-61]、高静水压处理[62]、电解水处理[63]、醋酸钠缓冲液处理[11]等有利于GABA的富集，但这些在绿豆中还没相关研究。

4 富含GABA的绿豆产品开发现状

目前市场上食品级的GABA产品主要来自发芽糙米、米胚芽、茶饮料、发酵豆制品，且国内外多家公司已通过发酵谷物(糙米为主)开发出食品级GABA 及相关产品，其中以日本市场最丰富，种类涉及粮食、茶叶、乳制品、饮料、巧克力和补充剂等。

近些年来，对于通过发芽使绿豆富集GABA的研究逐渐成为热点。苏晓琴等[64]筛选菌株得到一株产GABA的布氏乳杆菌，对绿豆进行发酵，最终制得消费者可接受度较高的富含GABA(23.44 mg/100 g)的功能性绿豆酸面团面包；郝文静等[49]利用发芽绿豆经打浆处理、通过外源添加谷氨酸钠、Ca2+、VB6等步骤进行生物转化法，获得的绿豆产品中GABA含量为796.58 mg/100 g(干基)，为开发高GABA保健豆芽浆、豆芽粉等豆芽深加工产品提供了可能。吴小勇等[65]以L-Glu浸泡绿豆使绿豆萌发，并将此种萌发后的绿豆提取液加工成了富含GABA且具有降血压功能的绿豆酸奶。邬海雄等[66]研究发现，将绿豆胚发芽18 h，并以此作为风味名食中山杏仁饼的原料具有较佳的品质特性，且GABA含量高达95.2 mg/100 g。顾振新等[47]将正常发芽的豆类芽菜置于培养液中进行低氧胁迫发芽(培养液中溶氧浓度为3.5～6.5 mg/L)，后经冷冻干燥后获得富含GABA(300 mg/100 g, DW)的冻干豆类芽菜。Park等[67]将富含GABA的发酵绿豆提取液应用于化妆品种，此种化妆品由于富含GABA，能起到促进胶原蛋白合成、减轻炎症、保护皮肤的作用。此外，大量研究显示[9, 25, 45-49]，绿豆发芽能够富集GABA，这为富含GABA绿豆芽及绿豆深加工产品的开发提供了依据。

然而，相比发芽糙米富集GABA的研究与应用，绿豆富集GABA的理论研究仍然缺乏，市场化产品非常有限，仍需加大科研投入，促进绿豆深加工产品的开发，加大绿豆深加工产品的市场占有率。

5 展望

绿豆营养丰富，且GABA代谢底物谷氨酸含量很高，是富集GABA的良好来源，已有大量研究表明绿豆发芽能够富集GABA。但从绿豆品种资源方面看，绿豆属于小宗作物，且绿豆品种与GABA富集之间的关系鲜见报道；从富集方面看，绿豆发芽富集GABA条件各异，外源添加物的引入也造成了安全隐患，且大多难以实现工业化；从加工损失方面看，绿豆经历发芽富集的GABA，又会因为食用前加工处理，如热处理等，造成GABA的显著损失，使其营养功能得不到最终发挥。因此，目前国内外市场上以绿豆为来源生产GABA或者富含GABA的绿豆相关功能性产品仍然十分匮乏。

总体来看，对于以绿豆为原料富集GABA及相应产品的开发，建议注意以下几个方面。第一，在原料选取方面，应从绿豆品种选择入手，关注绿豆品种与富集效果的关系，筛选出适宜于富集GABA的绿豆品种。第二，在GABA富集技术的改进与突破上，应简化富集工艺，降低生产能耗，减少外源物的添加，增加GABA富集过程的安全性及可行性。第三，在减少加工后期损失方面，则应选取适宜的加工工艺及产品类型，减小因高温熟化、灭菌等加工所造成的GABA损失，如选取GABA损失较少的微波加工方式的微波类产品。第四，在功能定位与产品标准方面，应从消费人群入手，开发针对特定人群的功能型产品，最终产品中GABA的含量以及产品的推荐食用量等均需给予标识。

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