不同措施对十字花科作物根肿病控制效果研究

白亭亭，杨佩文，李向东，杨子林，林兴华，毕云青，裴卫华，杨群辉，彭荣珍，杨明英 *

(1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；2. 临沧市植保植检站，云南 临沧 677000)

【研究意义】掌握有效控制十字花科根肿病的防控措施，对保障中国油料和蔬菜产业可持续发展具有重要的意义。十字花科根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)侵染引起的一种重要的土传病害，分布广泛，危害严重，可侵染大白菜、小白菜、油菜、甘蓝、萝卜等100多种十字花科植物[1-5]。根肿病病原菌侵染后会导致寄主植物根部细胞异常增殖，形成膨大的肿瘤，影响水分和营养物质的运输，造成植株地上部分营养不良和萎蔫，植物表现不同程度的萎黄；若幼苗感染病菌，则严重危害生长发育，甚至未成熟而死亡[6-8]，该病在生产上可导致寄主植物产量严重下降，甚至绝收，连茬种植情况越来越突出，极大地制约了油料和蔬菜产业的持续稳定发展，因此，寻找安全高效的防治措施迫在眉睫。【前人研究进展】 目前，防控十字花科根肿病的方法主要有抗病品种、轮作、无病土育苗移栽、土壤调理和关键化学防控等措施。化学农药在推荐剂量下相对安全，幼苗期施用对作物和人类更是影响甚小，尤其是一些新型低毒高效杀菌剂对环境也较安全，而且防治效果稳定，增产作用明显，杨佩文等和费维新等研究了福帅得、百菌清、多菌灵等对根肿病的防治效果[9-10]。土传病菌在土壤中居主导地位，致使土壤微生物多样性降低、结构和功能失调[11-12]，造成防治困难。土壤改良剂富含有益微生物和大量微量元素，具有提高土壤微生物多样性，促进土壤微生物生态系统恢复的作用[13]；轮作对土壤微生物群落也具有一定影响，每种植物的根际土壤微生物群落的种类和数量均不相同[14]，因此，能够增强土壤微生物多样性[15]，土壤微生物多样性丰富、有益微生物群落数量大能有效抑制病原菌防治土传病害[16]。【本研究切入点】十字花科根肿病化学农药防治研究虽有报道，但近年新研发的低毒高效农药明迪对十字花科根肿病的防治效果还未有研究；过去生物防治方面对于有益微生物防治十字花科根肿病的研究主要集中在放线菌和枯草芽孢杆菌等单一菌种[17-18]，含有复合微生物的土壤改良剂和有机硅肥对十字花科根肿病的防效研究仍属空白。【拟解决的关键问题】为了寻找安全高效防控措施，控制十字花科根肿病的发生和流行，提高十字花科蔬菜和油料的产量品质，本研究对4种化学农药、3种土壤改良剂和4种轮作方式进行田间防效试验，通过qPCR测定土壤中十字花科根肿病病原菌含量，结合田间发病株率调查，比较其不同防控措施的抑菌作用和对该病害的防控效果。

1 材料与方法

1.1 试验地情况

试验田选择在临沧市临翔区博尚镇永泉办事处讯房村张宝华户责任田中进行，海拔1810 m，经度100°2′26″，纬度23°42′4″，年平均温度17.5 ℃，土质砂壤土，浇灌方便。多年采用烤烟-油菜种植模式，油菜根肿病发生严重。

1.2 不同化学药剂试验

供试农药：明迪悬浮剂(有效成分含量：40 %氟啶胺·异菌脲)、福帅得悬浮剂(有效成分含量：40 %氟啶胺)、百菌清可湿性粉剂(有效成分含量：75 %百菌清)、多菌灵可湿性粉剂(有效成分含量：50 %多菌灵)，清水(CK)为空白对照。

试验设计：试验地为根肿病发生区，小区面积20 m2，共设6个化学农药处理和1个清水空白对照。分别为 A：40 %明迪(氟啶胺·异菌脲SC)1000倍液；B：50 %福帅得(氟啶胺SC)1500倍液；C：75 %百菌清800倍液；D：50 %多菌灵800倍液；E：福帅得+百菌清+多菌灵；F：明迪+多菌灵+明迪。每个处理设3个小区重复。除按试验要求施用药剂外，其它常规管理。

施药方法：明迪、福帅得、百菌清和多菌灵药剂，分别用单剂在油菜苗移栽后药液喷淋根部，之后每隔10 d施用1次，共施用3次；“明迪+多菌灵+明迪”组合指在油菜苗移栽实施明迪药液喷淋根部，10 d后施用多菌灵，再10 d后施用明迪；“福帅得+百菌清+多菌灵”组合指在油菜苗移栽后实施福帅得药液喷淋根部，10 d后施用百菌清，再10 d后施用多菌灵。油菜收获时采集土壤样品测定土壤中病原菌含量并调查油菜的发病株率。

1.3 土壤改良剂

供试土壤改良剂：抗重茬菌剂(有效活菌数≥2.0亿/g，有机质>40 %)、复合微生物菌剂(含芽孢杆菌和放线菌，有效活菌数≥20亿/g)和有机硅肥(SiO2≥27 %)。

施肥方法：抗重茬菌剂(30～60 kg/hm2)、复合微生物菌剂(45 kg/hm2)和有机硅肥(45 kg/hm2)在油菜移栽前取适量与常规用肥混拌均匀施于塘内后再移栽油菜，之后每隔1月结合追肥施用1次，共施用3次。油菜收获时采集土壤样品测定土壤中病原菌含量，并调查油菜的发病株率。

1.4 不同作物轮作

轮作试验设置4种作物：大蒜、大麦、蚕豆和马铃薯，对照地块继续种植油菜，每种作物轮作处理设3个重复小区，轮作1茬后采集土壤样品并测定土壤中病原菌含量。

1.5 发病株率调查

油菜收获时对不同处理、不同重复小区油菜进行拔根调查，记载总株数、发病株数，计算发病株率。

根肿病发病株率( %)=(发病株数/调查总株数)× 100

1.6 土壤样本采集

在油菜收获时，每个处理的不同小区采用对角线5点采样法，采集5份油菜根围10～30 cm深的土壤样品，5份土壤样品混匀为一份土壤样品装入密封袋。

1.7 土壤总DNA抽提方法及实时荧光定量PCR

土壤样品采用MoBio Power Soil DNA Isolation Kit(Catalog No.12888-50)抽提总DNA，然后进行实时荧光定量PCR分析土壤中十字花科根肿病病原菌含量，实时荧光定量PCR采用Takara SYBR Premix ExTaqTM (Tli RHaseH Plus)试剂盒(Code No. RR820)。

引物和具体程序均参照李淼等[19]，扩增的目的片段大小为158 bp，标准曲线的建立采用含有158 bp目的片段的重组质粒pMD18-T-158，测定抽提的质粒DNA的浓度，根据以下公式将质粒DNA的浓度换算成拷贝数，设置108、107、106、105、104、103copy number/μl 6个浓度梯度标准样品制作标准曲线，标准曲线要求R2>0.99，90

公式：{基因拷贝数=(6.02×1023copies/mol×质粒浓度g/μl)/MW g/mol，MW(双链DNA的平均分子量)= 碱基数×660/碱基}。

1.8 数据统计和分析

先使用SPSS 17.0统计分析软件对不同处理土壤病原菌含量进行差异显著性分析，差异显著性水平为P≤0.05，再用Excel 2007进行作图，获得不同处理的土壤中病原菌含量和油菜发病株率图。

2 结果与分析

2.1 不同药剂及组合对根肿病影响分析

检测不同化学农药及组合处理后土壤中十字花科根肿病菌含量，结果(图1)显示，施用3次明迪的土壤中病原菌含量最低，为1.7×107copy number/g，与对照、福帅得、百菌清及“福帅得+百菌清+多菌灵”处理的土壤中病原菌含量之间差异显著；“明迪+多菌灵+明迪”处理的土壤中病原菌含量为2.6×107copy number/g，与对照土壤、百菌清处理的土壤中病原菌含量之间差异显著；“福帅得+百菌清+多菌灵”处理的土壤中病原菌含量为2.8×107copy number/g，与对照土壤、百菌清处理的土壤中病原菌含量之间差异显著；而百菌清、多菌灵和福帅得处理的土壤中病原菌含量较高，与对照之间无显著差异。表明明迪对十字花科根肿病菌具有最好的灭杀效果。

收获期调查不同化学农药处理的油菜发病株率，结果(图1)表明，明迪和福帅得处理的油菜根肿病发病株率较低，分别为73.33 %和77.42 %，远低于对照；多菌灵和百菌清处理的油菜根肿病发病株率较高，分别为90.62 %和96.77 %，略低于对照；“明迪+多菌灵+明迪”处理的油菜发病株率为80%，“福帅得+百菌清+多菌灵”组合处理的油菜发病株率最低为63.33 %。表明“福帅得+百菌清+多菌灵”处理对十字花科根肿病具有最好的防控效果，其次为明迪和福帅得。

A: 明迪；B: 福帅得；C: 百菌淸；D: 多菌灵；E: 明迪+多菌灵+明迪；F: 福帅得+百菌淸+多菌灵A: Mingdi, B: Fushuaide, C: Baijunqing, D: Duojunling, E: Mingdi+Duojunling+Mingdi, F: Fushuaide+Baijunqing+Duojunling图1 不同药剂及组合对根肿病防控效果Fig.1 Control effect of different fungicides and combinations on clubroot of crucifers

2.2 土壤改良剂对根肿病影响分析

土壤改良剂能改善土壤性质，提高有机质含量，对土壤微生物产生积极的影响。本研究测定抗重茬菌剂、复合微生物菌剂和有机硅肥对病田土壤中根肿病的影响，结果显示，施用3种土壤改良剂后油菜发病株率均有所降低，其中抗重茬菌剂处理的油菜发病株率最低，为80.64 %；其次复合微生物菌剂处理的油菜发病株率为83.87 %，有机硅肥处理油菜的发病株率为90 %。土壤中病原菌含量测定结果显示，3种处理土壤中病原菌含量比对照均显著降低，但处理之间无显著差异，说明3种土壤改良剂在防控十字花科根肿病方面均具有显著效果(图2)。

2.3 轮作对土壤中根肿病病菌含量影响分析

轮作能减少土传病菌在土壤中的数量，减轻危害。文章研究了轮作大蒜、大麦、蚕豆和马铃薯4种作物对土壤中十字花科根肿病菌的影响。结果显示，轮作大蒜1茬后，土壤中病原菌含量明显降低，为2.2×107copy number/g，与对照、轮作大麦、蚕豆、马铃薯的土壤中病原菌含量有显著差异；而轮作大麦、蚕豆和马铃薯的土壤中病原菌含量与对照均无显著性差异，表明轮作大蒜对十字花科根肿病具有较好的控病效果(图3)。

2.4 不同防控措施对土壤中根肿病菌含量影响差异

通过检测，对照土壤中病原菌含量高达4.36 ×107copy number/g，文章分别使用不同化学农药、土壤改良剂和轮作等农业措施防治根肿病。结果发现，虽然这些防控措施能降低土壤中根肿病病原菌含量，但土壤中病原菌含量仍在107copy number/g 以上，主要原因是不同防控措施是在油菜移栽期和采用塘施方法，处理的土壤范围偏窄，加之病害调查和土壤取样在油菜收获期进行，因此土壤中病菌有一定的扩散，造成整体根肿病菌含量偏高。表明十字花科根肿病防治难度较大，单一的防控措施或土壤局部处理，不能在短时间内快速地减少土壤中的根肿病病原菌(表1)。

A: 抗重茬菌剂；B: 复合菌剂；C: 有机硅肥A: Anti-continuous cropping agent, B: Complex microbial community, C: Organic silicon fertilizer图2 不同土壤改良剂对根肿病菌抑制效果Fig.2 Suppression effects of different soil amendments on clubroot of crucifers

3 讨 论

3.1 化学药剂及组合控病作用

李妍等报道，1.6 ×105个休眠孢子/g 灭菌土是根肿病接种的发病阈值，应采取相应的防控措施减少土壤中孢子浓度[20]，本研究测定的土壤中病原菌含量均在107copy number/g 以上，表明属于根肿病重病田。

图3 轮作不同作物对病田中根肿病菌含量的影响Fig.3 Effect of different crop rotation on pathogen content of clubroot disease in soil

杨佩文等研究发现福帅得悬浮剂处理苗床及大田，能有效杀灭土壤中残存的病菌，控制根肿病的发生[9]，陈坤荣等报道15 % 氟啶胺的包衣悬浮剂处理油菜种子防治根肿病[21]。因此，文章选用低毒高效农药明迪、福帅得、百菌清和多菌灵，比较不同化学农药及组合对根肿病的防控效果。明迪处理的油菜田土壤中十字花科根肿病病原菌含量最低，且油菜的发病株率也较低，表明明迪对该病原菌的灭杀效果较好。福帅得比明迪处理的土壤病原菌含量显著的高，与对照无显著差异，明迪有效成分为氟啶胺和异菌脲复配制剂，福帅得的有效成分为氟啶胺，两种化学农药主成分相同，但含量和辅助成分不同，处理后土壤中病原菌含量有一定差异，表明含有两种有效成分的农药混剂较单一有效成分的农药控病效果好。

百菌清、多菌灵对根肿病的防控效果比明迪、福帅得稍差，处理的土壤中病原菌含量与空白对照无显著性差异，且油菜发病株率较高，这与杨佩文等研究结果一致[9]，但与费维新等的报道略有不同[10]，可能与施药处理方式和选择的试验田土壤中病原菌含量不均匀有关。“明迪+多菌灵+明迪”和“福帅得+百菌清+多菌灵”两个组合对根肿病有一定防效，几种药剂组合施用既可控病，还可以降低病原菌产生抗药性的机率，延长药剂的使用寿命。

3.2 土壤调理剂和轮作控病作用

土壤改良剂能够调控土壤微生物群落结构，增强土壤微生物及生态系统的平衡，抑制土传病原菌蔓延和危害的效果。研究发现经抗重茬菌剂、复合微生物菌剂和有机硅肥3种土壤改良剂处理的土壤病原菌含量与对照相比显著降低，油菜根肿病发病株率均比对照低，表明这3种土壤改良剂对控制根肿病具有一定的效果。轮作试验显示在所选的4种作物中，轮作大蒜能有效降低土壤根肿病菌的含量，其他3种作物轮作一季，对抑制根肿病菌不明显，可能需要轮作2～3年效果才会明显。

表1 qPCR测定不同处理下土壤中病原菌含量

十字花科根肿病的发生危害程度与土壤中病原菌的含量直接相关，研究发现化学农药、土壤改良剂和轮作等措施均能减少土壤中病原菌含量，单一的防控措施对根肿病有一定控制作用，但油菜发病株率仍较高，达不到防控目标，必须采取综合、持续有效的防控措施，才能达到控制根肿病发生危害的目的。

随着社会的发展，人们越来越认识到使用化学农药对生态环境和人类健康的危害，迫切需要应用抗病品种、生物和生态防控等优化的综合治理措施和策略。通过研究初步提出：对于重病田，可轮作2茬大蒜，有条件地方进行水旱轮作，待土壤中病原菌侵染力减弱、数量减少后，恢复种植十字花科作物；移苗前15 d用明迪处理土壤中残存的病原菌，移苗后连续施用土壤改良剂抑制土壤中病原菌侵染；对于轻病田，可直接在移苗前用明迪处理或连续施用土壤改良剂抑制土壤中病原菌。

4 结 论

采用实时荧光定量PCR检测技术测定土壤中根肿病菌含量的方法可行，检测结果可监测土壤中根肿病菌的残存量和分布特点，为预警监测提供理论依据。结果显示，明迪、福帅得、微生物菌剂及轮作大蒜控病效果较好。在生产中根据病害发生程度，建议采取“轮作+土壤调理+清理病根+化学药剂防控”综合防控措施，对减少化学农药的使用量，控制根肿病发生蔓延，具有较好的推广前景。

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