交通任督法干预对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马AchE活性的影响

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血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成记忆、认知和行为等脑区低灌注脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征，以记忆、认知、言语、情感、性格等方面的能力减退和消失为主要表现，是老年人群的常见病、多发病，仅次于阿尔茨海默病[1]。西医通常以改善脑细胞代谢、改善脑血液循环等对症治疗为主，目前无特效的治疗方法及药物[2]。交通任督法具有培元固本、通经活络、醒脑开窍的作用，临床证实对VD病人效果明显。现代医学临床、基础研究结果证实，中枢神经系统胆碱能系统功能损害与VD病人认知功能障碍密切相关，本实验观察交通任督法对VD大鼠学习记忆功能及海马乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的影响，探讨其治疗机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 成年SD雄性大鼠40只，体重400 g±10 g[动物由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2014-0004]，实验动物筛选剔除后随机分为假手术组、模型组、交通任督法针刺组、西药对照组，每组10只。

1.2 仪器 Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所DMS-2，山西省中医药研究院中心实验室提供)；YL-3型石蜡切片机(上海仪表厂)；4号手术丝线[强生(中国)医疗器械有限公司]，眼科用手术剪(上海医疗器械厂)，眼科用手术镊(上海医疗器械厂)。

1.3 药品及试剂 水合氯醛(国药集团上海化学试剂公司)，尼莫同(由德国拜耳公司提供)，硝普钠(北京双鹤药业股份有限责任公司)，注射用青霉素钠(华北制药有限公司)，生理盐水、乙酰胆碱酯酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)。

1.4 针具 “汉医牌”一次性针灸针(0.25 mm×25 mm)：北京汉医医疗器械中心。

1.5 造模方法 大鼠进行常规喂养适应5 d后，进行Morris水迷宫预实验筛选，统计所有大鼠潜伏期均值，剔除太快及太慢的，将剩余大鼠根据潜伏期分为3组：0～20 s、20 s～40 s、40 s～60 s，从每组随机选出3只或4只大鼠，共10只作为假手术组(空白组，手术期间可能存在大鼠死亡)，余为造模组。

采用两血管阻断加硝普钠降压法复制VD模型[3-5]：将大鼠用10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉；腹腔注射硝普钠(3.5 mg/kg体重)后，随即用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉，夹闭10 min再通10 min，反复3次，再通后在手术处撒适量青霉素粉末，缝合伤口，放回笼中保温饲养。假手术组麻醉及手术过程同上，但不阻断颈总动脉及注射硝普钠。

1.6 治疗方法 术后第7天切口愈合，存活大鼠再次进行Morris水迷宫测试(除假手术组)，存在显著学习记忆障碍的大鼠为VD大鼠模型(以第1次水迷宫检测的大鼠逃避潜伏期均值作为参考值，计算造模后大鼠逃避潜伏期均值和参考值之差与参考值的比值，大于20%为痴呆大鼠)。将第2次水迷宫实验选出的造模组大鼠随机分为交通任督法针刺组、西药对照组、模型组，每组10只。假手术组及模型组未予任何治疗。

1.6.1 交通任督法针刺组 针刺模型大鼠“风府”“百会”“人中”“关元”穴(取穴参照林文注等编著的《实验针灸学》[6])，深度约0.5寸，平补平泻，留针30 min，每日1次，连续15 d。

1.6.2 西药对照组 模型大鼠给予尼莫同12 mg/kg(尼莫同每片30 mg，10片，先用少量温水制成混悬液，再加蒸馏水至500 mL，即为0.6 mg/mL的尼莫同混悬液)，按20 mL/kg体重灌胃，每日1次，连续15 d。

1.7 检测方法

1.7.1 行为学观测 Morris水迷宫定位航行试验：治疗结束后，进行水迷宫测试。水迷宫为高50 cm、直径150 cm的圆形水池，水深30 cm，水温保持在(20±2)℃。将水池等分为4个象限，任选一象限作为第一象限，并在其正中离池壁30 cm处放一直径为9 cm的圆形平台，平台顶低于水面1 cm。自动摄像系统同步记录大鼠运动轨迹，整个训练期间迷宫外参照物保持不变，避免时间、光线等外界条件的干扰。将大鼠置于平台10 s，再将其从平台对侧象限面对池壁入水，开始自由游动，记录1 min内寻找平台时间(逃避潜伏期)。若大鼠在1 min内找到平台，记录其实际逃避潜伏期及游泳路程；若大鼠在1 min内未找到平台，由测试者将其引上平台并停留10 s，逃避潜伏期记录为1 min，观察3 d，每日2次。以3 d找到平台的平均逃避潜伏期和平均游泳路程评价动物的学习记忆能力[7]。

1.7.2 海马AchE测定 大鼠断头后快速取出全脑，置于冰盒上，分离海马并称重。按照重量和体积1︰10的比例，加入生理盐水冰浴匀浆，4 ℃离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，酶联免疫吸附法测定，操作遵照试剂盒说明进行。

2 结 果

2.1 对VD大鼠学习记忆能力的影响 大鼠逃避潜伏期和游泳路程比较，假手术组、交通任督法针刺组和西药对照组均短于模型组(P<0.01)。详见表1。

组别n逃避潜伏期(s)游泳路程(cm)假手术组 1010.55±2.131)112.27±20.631) 模型组 1057.07±6.40 938.66±246.83 交通任督法针刺组1019.64±8.651)228.39±106.471)西药对照组 1018.93±9.031)227.39±105.891) 与模型组比较,1)P<0.01。

2.2 各组大鼠海马组织AchE活性表达 大鼠海马AchE含量比较，假手术组、交通任督法针刺组、西药对照组均高于模型组(P<0.01)。详见表2。

组别 nAchE假手术组 10500.51±35.651)模型组 10420.05±15.22 交通任督法针刺组10466.87±22.551)西药对照组 10471.77±18.631) 与模型组比较,1)P<0.01。

3 讨 论

交通任督法是指取任督二脉之经穴为主 ，施以相应的针刺手法，以达到调整人身阴阳、通畅经络气血、祛除疾病目的。郭耀康老师从事针灸临床工作40余年，认为人体疾病发生的根本为阴阳失调，如《素问· 阴阳应象大论》曰：“ 阴阳者，天地之道也，万物之纲纪，变化之父母，生杀之本始，神明之府也” 。而任督二脉为人身阴阳的总汇，两者一源而二歧，督则由会阴而行背，任则由会阴而行腹，最后交接于口周。督脉总督一身之阳，任脉总督一身之阴，任督二脉共同构成一个阴阳循环的体系，故任督二脉经气循环通畅，对于五脏六腑、十二经脉起重要的影响和治疗作用[8]。

VD属于中医“痴呆”的范畴，较早有认识，《灵枢·海论》曰：“髓海不足，脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧”。《灵枢·调经论》曰：“血并于上，气并于下，乱而喜忘”；《临证指南医案》指出：“中风初起，神呆遗尿。老人厥中显然”；《杂病源流犀烛·中风》更进一步指出：“有中风后善忘”。其病位在脑，病机为髓海不足，气、火、痰、瘀内阻于脑。痴呆的发生与任督二脉密切相关，从循行分布上看，《难经·二十八难》记载：“督脉者……起于下极之腧，并于脊里，上至风府，入属于脑”“任脉者，起于中极之下，以上至毛际，循腹里……入目络舌”；又如《素问：骨空论》记载督脉的分支“上额交巅上，入络脑”“督脉、任脉和诸阳皆起于头”。从功能角度上看，脑位于颅内，为髓之海，其功能的发挥依赖任脉的气血津液濡养；督脉则通髓达脑。因此，任、督脉对治疗脑部疾病有重要意义，运用任督二脉的腧穴，可有效调整人体阴阳平衡[9]。郭耀康老师治疗痴呆常选用任督二脉之关元、中脘、承浆、人中、百会、风府。交通任督法的取穴：关元是人体的强壮要穴，可鼓舞人体正气；中脘穴为任脉上六腑经气交会之处，可振奋脾胃功能，使人体气血调和，经脉通畅；承浆穴是任督二脉交会之处，又是足阳明经左右交叉之地，可用于“卒中恶死”“偏风半身不遂，口眼歪斜，暴暗不能言”等；人中穴为督脉、手足阳明之会穴，可调节脑内气血的偏盛偏衰；百会是督脉要穴，针刺可疏通督脉经气；风府穴为督脉入属于脑之处，故脑部疾病常用。以上各穴合用，共奏调理阴阳、疏通经络之效[10]。

随着社会人口老龄化及脑血管病发病率不断上升，致使当前VD的发病率、致死率逐年增加[11]。 尤其在世界多数发展中国家，VD已成为继阿尔茨海默病后导致老年性痴呆的第二大原因[12]。由于VD病人除神经系统定位损害的症状和体征，其还存在不同程度的记忆、计算、思维、定向和判断等能力障碍，同时病人的生活质量有不同程度下降，给病人及家庭带来沉重的心理负担，同时也加重社会负担，而VD作为目前唯一一种可预防的痴呆类型，若病人及早发现、早期诊断明确、及时干预治疗，VD是可以防治的，是可逆的[5]。

现代医学认为海马组织是学习记忆的高级活动中枢，其胆碱能神经元胆碱(Ach)的含量与记忆功能密切相关，Ach在胆碱乙酰转移酶(ChAT)催化下合成，释放后被AchE迅速水解，ChAT与AchE共同维持Ach的动态平衡，因此通过测量AchE含量可了解Ach的代谢状况[11-12]。由本实验结果表明：VD模型组大鼠AchE含量较假手术组降低，学习记忆能力下降；而针刺组、西药组大鼠AchE含量较VD模型组大鼠升高，学习记忆能力增强。证实交通任督针法可提高VD大鼠的学习记忆能力，提高VD大鼠海马组织AchE的含量，其作用机制可能与调节AchE的代谢有关。

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