五苓散对脑梗死小鼠脑水肿及线粒体生物合成的影响

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脑梗死作为一种常见的脑血管疾病，具有较高的致残率和致死率，早期干预可使10%～50%卒中病人的认知功能得到一定程度改善[1-2]。多项研究证实，应用五苓散可有效改善病人脑水肿和神经功能损伤症状，但具体机制尚不明确。线粒体是机体能量代谢的重要场所，线粒体功能障碍与细胞毒性脑水肿及神经功能损伤程度密切相关，提示线粒体可能是五苓散发挥脑保护作用的重要靶点之一[3-5]。本研究拟通过构建小鼠脑缺血再灌注(MCAO)模型，探讨五苓散对脑水肿的影响，并进一步检测线粒体生物合成相关基因表达及线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷贝数的变化，为五苓散治疗脑梗死的机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂、仪器 雄性C57BL/6小鼠30只，体重25 g～30 g，购于军事医学科学院动物实验中心。总RNA/DNA共提取试剂盒(天根公司)，cDNA第一链合成试剂盒(天根公司)，real-time PCR剂盒(康为世纪公司)，real-time PCR仪(美国ABI公司，Step One Plus)，小动物麻醉机(瑞沃德公司)。

1.2 方法

1.2.1 五苓散配制 茯苓9 g，猪苓9 g，白术9 g，泽泻15 g，桂枝6 g，煎煮两次，合并药液后稀释成1 g/mL，4 ℃保存。

1.2.2 分组及相应手术操作 将小鼠随机分为对照组(S组)、大脑中动脉栓塞组(MCAO组)和五苓散组(W组)，各10只。MCAO组和W组采用线栓法构建右侧大脑中动脉栓塞模型：首先，以400 mL/min流量，2%浓度异氟烷麻醉小鼠后，取颈正中切口，分离颈内、外动脉；其次，结扎颈外动脉根部和颈总动脉近心端，另分别在颈内动脉和颈总动脉距远心端3 mm～5 mm处套线不结扎，为下一步线栓插入做准备；最后，颈总动脉远心端处夹一动脉夹，并在颈总动脉两线之间剪一斜形切口，将单丝尼龙线(6-0)从切口插入至动脉夹处，之后结扎颈总动脉远端套线，松开动脉夹，继续向颈内动脉插入1 cm左右，遇阻力时即停止，缝合皮肤并将线栓一头留在体外，1 h后拔出线栓完成再灌注。MCAO组按1 mL/100 g给予生理盐水灌胃，每日3次；W组按1 mL/100 g给予五苓散灌胃，每日3次；S组仅暴露颈内动脉后缝合皮肤。

1.2.3 MCAO模型评价 麻醉清醒后，小鼠出现如下3种状态之一，认为MCAO造模成功：①不能完全伸展单侧前肢；②向单侧转圈；③向单侧倾斜[6]。

1.2.4 神经功能损伤评分(mNSS)及标本采集 3组小鼠均于术后72 h行mNSS评分[6]，分数越高说明症状越严重，0分为正常，最严重为18分。评价完成后采用颈椎离断法处死小鼠，MCAO组及W组留取缺血半暗带同一部位约10 mg脑组织，S组留取相应部位脑组织。剩余脑组织进行干湿比重测量。

1.2.5 相关基因表达及mtDNA拷贝数测定 按照试剂盒说明书，提取脑组织的总RNA和基因组DNA，并将RNA反转录成cDNA，以测定线粒体生物合成相关基因的表达变化，包括受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferators activated receptor gamma coactivator-1 alpha，PGC-1α)、核呼吸因子1和2(nuclear respiratory factor 1/2，NRF1/2)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)及线粒体单拷贝基因COX2。方法如下：配制PCR反应体系，包括2×UltraSYBR Mixture，cDNA 10 ng或基因组DNA 50 ng及相应体积的引物和灭菌双蒸水，每个基因设置3个重复孔。反应条件采用两步法：95 ℃，10 min预变性，随后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环测定CT值，以0.3 ℃梯度逐步升温行融解曲线分析。应用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.6 脑组织含水量测定 去除嗅球、小脑和脑干后，分离左右大脑半球，立即称重(湿重)。之后将大脑放入烘干箱中，75 ℃烘烤48 h后称重(干重)。含水量=(湿重-干重)/湿重。

2 结 果

2.1 3组mNSS评分比较 S组、W组和MCAO组mNSS评分依次升高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

2.2 3组各基因表达及mtDNA拷贝数变化比较 S组、MCAO组和W组大鼠脑组织PGC-1α和TFAM 基因表达及mtDNA拷贝数依次增高，差异有统计学意义(P<0.05)。MCAO组和W组大鼠脑组织NRF1和NRF2表达差异无统计学意义(P>0.05)，但均显著高于S组(P<0.05)。详见表2。

组别mNSS评分(分)PGC-1αNRF1NRF2TFAMmtDNA拷贝数W组 5.30±1.651)2) 4.97±1.321)2) 3.04±1.501) 2.70±1.061) 2.89±0.201)2) 7.82±3.201)2)MCAO组 7.30±1.591) 1.86±0.611) 2.86±1.431) 2.98±1.221) 1.83±0.351) 5.50±1.421)S组 0.10±0.32 1.04±0.31 1.20±0.48 0.93±0.60 1.01±0.55 1.10±0.82 与S组比较,1)P<0.05;与MCAO组比较,2)P<0.05。

2.3 3组脑组织含水量比较 MCAO组、W组和S组大鼠患侧脑组织含水量依次降低分别为0.798±0.014，0.781±0.011与0.760±0.009，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

脑水肿是脑梗死后常见的并发症之一，常于发病后第3天～第5天达到高峰，缺氧的脑细胞发生水肿后，可使颅内压急剧增高，进一步使脑部血液灌注减少，过高颅内压压迫正常脑组织，进一步加重病情，甚至导致脑疝威胁生命[7]。

五苓散是《伤寒杂病论》中利水渗湿的代表方，具有利湿行水，温阳化气的功效，在脑梗死治疗中可作为辅助用药。本实验结果表明，五苓散可有效减轻脑缺血再灌注小鼠神经功能损伤症状，并降低脑梗死后脑水肿的严重程度，这与李星瑞等[8]研究结果一致，发现应用五苓散治疗脑梗死可有效改善病人神经功能损伤程度，但目前五苓散发挥脑保护作用的具体机制尚不明确。

线粒体是通过氧化磷酸化为细胞活动提供能量的重要细胞器，当缺血缺氧导致线粒体功能障碍时，引起细胞内乳酸堆积并影响Na+-H+交换，促进脑水肿的发生[9]。本研究探讨脑组织mtDNA拷贝数及线粒体生物合成相关基因表达的变化。结果发现，脑梗死后脑组织中mtDNA拷贝数显著增加，表明缺氧在造成线粒体损伤后，mtDNA发生代偿性扩增。一方面，mtDNA是独立存在于细胞器中的基因组DNA，其在基因组中的个数称为mtDNA拷贝数，由于缺少组蛋白保护，mtDNA易受到氧化应激、炎症等危险因素损伤，造成基因突变及线粒体功能障碍[10-11]，脑梗死后，局部脑组织因氧化应激产生大量活性氧，从而造成mtDNA损伤。另一方面，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)造成mtDNA损伤同时，本身可作为第二信使，触发TFAM和NRF表达，促进线粒体扩增以降低功能障碍mtDNA所占比例，代偿能量供应水平的下降[12-13]。应用五苓散后，可见大鼠PGC-1α基因及下游TFAM基因表达进一步升高，且mtDNA拷贝数显著提高，表明五苓散可能通过激活PGC及下游通路，促进mtDNA的生物合成，增强缺血缺氧脑组织的能量供应，改善脑水肿程度，发挥脑保护作用。

综上所述，本实验通过构建脑缺血再灌注小鼠模型，初步探讨五苓散对脑水肿及线粒体生物合成基因的影响，为解释五苓散发挥脑保护作用的机制提供基础研究。脑梗死发病是多因素共同造成的，其发生发展涉及其他多条通路及靶基因，仍有待进一步研究。若能进一步探讨五苓散对其他通路的影响，可能为脑梗死的临床治疗用药及发现五苓散的新用途提供依据。

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