SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统在华东汉族人群中的法医学应用

包 云 ，盛 翔 ，张家硕 ，李 敏 ，李亚男 ，徐倩南 ，李成涛 ，陈丽琴

（1.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010030；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.苏州大学医学部法医学系，江苏 苏州 215123；4.温州医科大学法医学系，浙江 温州 325035）

短串联重复序列（STR）具有高度多态性，结合毛细管电泳技术可快速完成检测，已成为法医DNA分型的主流遗传标记及主要检测技术[1-2]。目前，法医DNA领域常染色体STR商品化试剂盒多达十余种，可检测的遗传标记包括CODIS核心STR基因座、拓展CODIS基因座，欧洲核心（European Standard Set，ESS） STR基因座及补充ESS基因座[3]。

2017年，司法鉴定科学研究院（原司法部司法鉴定科学技术研究所）针对中国汉族人群的特点，结合SF/Z JD0105001—2016《亲权鉴定技术规范》对案件检测提出的最新要求，开发了一款可并行扩增21个常染色体STR基因座、DYS391基因座和Amelogenin性别基因座的检测试剂盒，即SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统。21个常染色体STR基因座中包含了全部CODIS基因座（13个）和5个拓展CODIS基因座（D1S1656、D2S1338、D10S1248、D12S391、D19S433），并将拓展CODIS基因座中的D2S441和D22S1045替换成在中国汉族人群中多态信息含量更为丰富的Penta D和Penta E基因座，另外，还加入了针对汉族人群开发的多态性STR基因座D6S1043[4]。

为有效评估上述STR基因座在法医遗传学中的应用效力，本研究拟通过大样本调查及大量案件的应用，分析上述STR基因座的遗传学参数信息、突变信息及这一检测试剂盒的法医学应用价值。

1 材料与方法

1.1 样本

收集本实验室采用Goldeneye®DNA身份鉴定系统20A试剂盒［基点认知技术（北京）有限公司］检测后亲子鉴定意见为支持的3198例华东地区案例，其中三联体859例，二联体2339例。案件样本均为汉族，且签署知情同意书。

对上述案件采用SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统（司法鉴定科学研究院）进行检测。其中，三联体案件中被检父亲与被检母亲认为系无关个体，则含有无关个体1 718名；二联体案件中选择被检孩子作为无关个体，则产生2339名无关个体。采用随机函数法从中选择2000名个体（男性1000名，女性1000名）进行群体遗传学调查。

1.2 DNA提取和STR分型

采用GA/T 383—2014《法庭科学DNA实验室检验规范》中Chelex-100法对样本基因组进行DNA提取[5]。用SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统进行复合扩增，扩增体系为 10 μL，包括：2×PCR 反应预混液Ⅴ 5 μL，5×SiFaSTRTM23 引物混合物 2 μL，6×Enhancer 1.6 μL，DNA 模板 1 μL，去离子水 0.4 μL。 扩增条件为：95℃ 5min预变性；95℃ 15s，61℃ 30 s，72℃ 30 s，29个循环；60℃ 30 min延伸；15℃保存。选用9700型PCR仪（美国AB公司）的MAX模式进行扩增。扩增产物在3130xl基因分析仪（美国AB公司）上进行毛细管电泳，采用GeneMapperTMID-X软件进行基因分型。

1.3 突变基因座的确定

根据SF/Z JD0105001—2016《亲权鉴定技术规范》，确定亲子关系的案件要求累积父权指数（CPI）大于10000，其中不符合遗传规律的基因座视为突变基因座。本研究中当采用SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统对亲子鉴定样本进行21个常染色体STR基因座检测无法满足CPI〉10000时，采用Goldeneye®DNA身份鉴定系统22NC试剂盒［基点认知技术（北京）有限公司］进行补充检测。

1.4 数据分析及统计学处理

应用Modified-Powerstates软件[6]对21个常染色体STR基因座进行Hardy-Weinberg平衡检验，获得21个常染色体STR基因座的等位基因、等位基因频率、个体识别率（DP）、多态信息含量（PIC）等群体遗传学参数。采用Arlequin v3.5.2.2软件计算期望杂合度（He）、观察杂合度（Ho），并完成 STR 基因座之间连锁不平衡分析；三联体非父排除率（PEtrio）、二联体非父排除率（PEduo）、三联体累积非父排除率（CPEtrio）及二联体累积非父排除率（CPEduo）按照司法部发布的SF/Z JD0105001—2016《亲权鉴定技术规范》计算；累积个体识别率（CDP）、基因多样性（GD）参照文献[1]计算。

使用网站（http://statpages.org/confint.html）在线计算突变率和 95%置信区间（95%CI）[7]，并通过 SPSS 13.0软件分析各基因座之间突变率的差异。通过STRbase 网站（http://www.cstl.nist.gov/strbase/）查阅21个常染色STR基因座的突变率，并使用SPSS 13.0软件分析本研究报道的突变率与该突变率是否存在统计学差异。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 等位基因分布情况

通过对2 000名随机汉族无关个体的基因型数据分析，21个常染色体STR基因座共检出289个等位基因，1252种基因型，等位基因频率范围为0.0003～0.5225，其中Penta E基因座检出的等位基因最多，为27个，TH01基因座检出的最少，为7个。DYS391基因座共检出5个等位基因，等位基因频率范围为0.0040～0.7290，GD 为 0.4189，DYS391与 Amelogenin基因座性别基因完全匹配，在女性样本中未发现DYS391基因座扩增产物。21个常染色体STR基因座及DYS391基因座的等位基因及其频率分布详见表1。

表1 21个常染色体STR基因座及DYS391基因座的等位基因频率分布 （n=2000）

表1（续）

2.2 群体遗传学参数

经Bonferroni校正后，21个常染色体STR基因座的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P〉0.05）。

21个常染色体STR基因座的群体遗传学参数见表2，其中 Ho为 0.6175～0.9270，DP 为 0.7964～0.9869，PIC为0.5611～0.9123。经Arlequin v3.5.2.2软件分析，各基因座之间相互独立，属于连锁平衡状态，可以运用乘积定理计算，CDP 为 0.999999999999999，CPEduo为0.999997431701961，CPEtrio为 0.999999999654865。

表2 21个常染色体STR基因座的群体遗传学参数 （n=2000）

2.3 突变情况

3198例华东地区支持亲子关系的案件中，共观察到4 057次减数分裂，21个常染色体STR基因座上有85 197次等位基因传递。本次检测发现：有73例案件存在突变，其中3例出现2个STR基因座同时发生突变；除D13S317和D10S1248基因座外，其余19个基因座上共发生76次等位基因传递不平衡，突变率为 0.2465×10-3～2.711 4×10-3。 19 个常染色体STR基因座中突变率最高的基因座为FGA（95%CI为1.40×10-3～4.80×10-3），突变率最低的基因座为 D7S820、Penta D 和 TPOX（95%CI为 0～1.40×10-3），21 个常染色体STR基因座的平均突变率为0.8921×10-3（95%CI为 0.70×10-3～1.10×10-3），各基因座的突变情况见表3。

表3 21个常染色体STR基因座在华东地区汉族人群中的突变来源及突变率

对各STR基因座的突变率经χ2检验发现，χ2=51.704，P〈0.05，提示各基因座的突变率之间差异具有统计学意义。另外，与STRbase网站可查阅的基因座突变率数据进行χ2检验，发现除D13S317和TH01外，其余基因座突变率与网络公布的数据比较，差异均无统计学意义。

2.4 突变来源、突变步数及重复单位增减分析

73例突变案例中，三联体为33例（34次突变），二联体为40例（42次突变）。父亲来源的突变为59例（62次突变），母亲来源的突变为14例（14次突变）。33例三联体中来自父系的突变23次，来自母系的突变11次，父、母源性突变比例为2.09∶1。

76次突变事件中，75次（98.68%）为一步突变，1次（1.32%）为三步突变。突变表现为重复单位增加的有38次，重复单位减少的有31次，不能确定的有7次，增加和减少的比例为 1.23∶1。 经 χ2检验，χ2=0.828，P〉0.05，提示一步突变与二步以上突变中重复单位增加和减少的差异无统计学意义。

3 讨 论

3.1 STR基因座的法医学参数

GILL等[8]认为 DP≥0.9、Ho≥0.7的基因座具有高鉴别能力，本研究21个常染色体STR基因座中，除 D3S1358、CSF1PO、TPOX 和 TH01基因座外，其余17个常染色体STR基因座均具有高度多态性。由于D3S1358、CSF1PO、TPOX和 TH01基因座属于美国联邦调查局（Federal Bureau of Investigation，FBI）于2017年1月1日强调要求的CODIS核心基因座[9]，故SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统仍将其包括在内。21个常染色体STR基因座中，Penta E基因座多态性程度最高（Ho为 0.9270，DP 为 0.9869，PIC 为 0.9123），其次为D6S1043基因座（Ho为0.8810，DP为0.9685，PIC为0.8565）。D6S1043基因座最早应用于商业化Sinofiler试剂盒（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）[9]，是针对中国人群开发的多态性STR基因座。

3.2 21个常染色体STR基因座的突变率

21个常染色体STR基因座中，有19个基因座共出现76次等位基因传递不平衡，D13S317和D10S1248基因座中未观察到突变，除Penta E和FGA基因座外，其余19个常染色体STR基因座的突变率均小于0.002，各基因座的突变率之间差异具有统计学意义。另外，本研究发现D13S317和TH01基因座的突变率与STRbase公布的突变率数据差异具有统计学意义，推测与两个原因相关：一是调查家系的大小，STRbase突变数据库的调查来自于44个实验室多年数据的积累，其中D13S317基因座的研究涉及1 103 282次减数分裂，TH01基因座的调查涉及779 554次减数分裂；二是调查人群的差异，本次研究对象为华东地区汉族人群，而STRbase研究对象主要为欧洲及美国高加索人群。这一现象也提示我们，对于研究人群及家系的深入调查有助于获取更为准确的突变率信息。

本研究21个常染色体STR基因座的平均突变率为 0.892 1×10-3（95%CI为 0.70×10-3～1.10×10-3），比SF/Z JD0105001—2016《亲权鉴定技术规范》中推荐的平均突变率低，推测这主要是由于一些突变事件在二联体案件中可能被忽略。

本研究发现多数杂合度高的STR基因座，通常具有较高的突变率，但个别存在差异，如D6S1043基因座有较高杂合度，突变率却为 0.9860×10-3（0.30×10-3～2.50×10-3）。这一现象在邱平明等[10]研究中进行过深入调查，认为杂合度与突变率之间并无统计学相关性。本研究结果也验证了这一观点，可认为D6S1043基因座具有高多态性和低突变率，在亲子鉴定中应用价值较高。

3.3 21个常染色体STR基因座的突变情况

目前，逐步突变模式（stepwise mutation model，SMM）是多数学者认可的STR基因座突变模式，即多步突变是在一步突变的基础上逐步形成的，并且概率非常低[11]。其主要机制是复制滑动或者滑链错配，90%以上STR基因座的突变表现为增加或减少一个重复单位[11]。本实验观察结果与其一致，一步突变占98.68%，二步以上突变占1.32%，一步突变与二步以上突变中重复单位增加和减少的差异无统计学意义。

STR基因座的突变存在性别差异，父源突变比母源突变更常见，原因是突变与干细胞分化过程中细胞所经过的分裂次数有关[12]。本研究中，三联体父源性与母源性突变的比例为2.09∶1，父源突变率较高，但突变比例与文献报道的中国群体研究的结论（3.06∶1[13]，4.3∶1[14]，7.2∶1[15]）有差异，分析可能与研究的样本量、群体结构及STR基因座的突变特征等有关[10]。

综上，SiFaSTRTM23plex DNA身份鉴定系统在华东地区汉族人群中具有良好的遗传多态性。根据SF/Z JD0105001—2016《亲权鉴定技术规范》要求计算，得到该身份鉴定系统的CPEduo值为0.999997431701961，CPEtrio值0.999999999654865，可满足法医学亲权鉴定要求。

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