RapidHITTM200系统在法医学中的应用

孙 帅 ，田雨苗 ，汤继明 ，张庆霞 ，胡玉龙 ，王鹏飞 ，薛卢艳 ，刘 力 ，唐 晖

（1.山西医科大学晋祠学院，山西 太原 030025；2.山西医科大学第一临床医学院，山西 太原 030001；3.阿克苏地区公安局，新疆 阿克苏 843000；4.北京市公安司法鉴定中心，北京 100192；5.鄂尔多斯市公安局禁毒支队，内蒙古 鄂尔多斯 017000；6.包头市土默特右旗公安局，内蒙古 包头 014100；7.浙江迪安鉴定科学研究院，浙江 杭州 310030）

近十年来，DNA自动化分析技术取得了显著进步[1-7]。应用微流控芯片技术研发的RapidHITTM200系统[8]集DNA提取、扩增、电泳和分析四大功能于一体，可实现样品检测自动化，减少人为操作，降低产生污染的风险，且大幅缩短了检验时间，全部检验可在2h内完成。鉴于该平台目前在法医物证学实验室尚未大规模使用，本研究主要探讨该系统对法医学四类常见检材的检测效能以及两次重复检测运行中模板、模板DNA和PCR产物的再利用效能，以期为同行提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

RapidHITTM200系统（美国IntegenX公司），Maxwell®16核酸提取仪（美国Promega公司），9700型PCR仪、3130xl基因分析仪（美国AB公司）。

DNA IQTMCasework Pro 试剂盒、PowerPlex®16 HS系统（美国Promega公司），GlobalFilerTMPCR扩增试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 检材及实验方法

选取7名志愿者，使用医用棉签进行口腔擦拭，依次标记为A1～A7。首先将A1～A7口腔拭子检材依序置入RapidHITTM200系统进行检测，运行结束后取出拭子检材再依序置入新的样品盒进行检测。

提取两次检测过程中产生的模板DNA、PCR产物进行检测，即模板DNA首次、再次检测和PCR产物首次、再次检测。其中，模板DNA首次、再次检测定义为：使用医用棉签擦拭RapidHITTM200系统首次和再次运行后微流控区的模板DNA（1 μL），进行PCR扩增和后续电泳检测；PCR产物首次、再次检测定义为：使用枪头吸取RapidHITTM200系统首次和再次运行后微流控区的PCR产物（2μL），并进行电泳检测。

在RapidHITTM200系统进行法医学四类常见检材检测分析，涉及口腔拭子9例，血拭子13例，烟蒂9例，心脏、肝、肺、脑、肾、胰腺、皮肤、脾等组织17例（组织为现取未降解的检材且体积均为1 cm×1 cm×1cm，来自于实际案件，符合伦理学要求）。同时，针对运行后的检材采用DNA IQTMCasework Pro试剂盒经Maxwell®16核酸提取仪进行DNA提取，并完成PCR扩增及电泳检测。另外，与上述方法类似，采集检材在RapidHITTM200系统运行中产生的模板DNA和PCR产物进行后续检测，即完成模板DNA首次检测和PCR产物首次检测。

因样品在样品盒中有可能发生漂移，使用Rapid-HITTM200系统时需对检材作固定处理。该系统设有两种检测模式：一种针对常量检材，选用口腔拭子模式；另一种针对微量检材，选择其他工具模式。常量检材的PCR循环次数比微量检材少两个循环，本研究所涉及的检材均为常量检材，选择口腔拭子模式进行检测。仪器运行结束后，样品盒中会留有运行后的检材、模板DNA、PCR产物，其中经过运行的检材可以通过打开无菌封装口用消毒镊子夹取置于微量离心管中（运行前同种检材的检材量相同，运行后同种检材的检材取等量进行后续实验）；模板DNA可以在微流控模板DNA收集区收集；PCR产物可以经由100μL枪头穿破无菌的样品盒外包装塑料膜吸取获得。本次研究中DNA均采用GlobalFilerTMPCR扩增试剂盒完成PCR扩增，PCR产物经3130xl基因分析仪完成电泳，并采用GeneMarker®HID v2.6.13软件进行DNA分型。

1.3 评判标准

STR基因座检出率是指所检出的STR基因座数目与扩增试剂盒所含STR基因座数目的比值。一致性检测结果好的标准定义为相比较的两次检测STR基因座检出率均〉95%。

2 结 果

2.1 口腔拭子的检测结果

口腔拭子（A1～A7）经 RapidHITTM200系统两次运行后的结果见表1。首次运行后的检材经电泳检测基因座均完全检出，然而再次运行的检材存在部分等位基因丢失现象。上述检材进行两次系统检测的平均STR基因座检出率均可达95%以上，可认为一致性检测结果好。

表1 口腔拭子经RapidHITTM200系统两次运行后的STR基因座检出率 （%）

口腔拭子A2经RapidHITTM200系统首次与再次运行后的DNA分型图谱见图1，发现首次运行后各基因座的峰值范围为1000～10000RFU，再次运行后各基因座的峰值范围为200～1500RFU。

口腔拭子经RapidHITTM200系统两次运行后，模板DNA首次、再次检测和PCR产物首次、再次检测的结果见表2。结果显示，这四种检测的平均STR基因座检出率均〈95%，模板DNA再次检测和PCR产物再次检测的平均STR基因座检出率〈50%。

2.2 法医学常见检材的检测

口腔拭子、血拭子、烟蒂及人体组织检材经Rapid-HITTM200系统首次运行后STR基因座检出率可达到80%以上，均优于运行后检材的再检测效果。另外，模板DNA的首次检测效果优于PCR产物的首次检测效果，但比检材经RapidHITTM200系统检测的效果要差。其中，经RapidHITTM200系统运行后的组织类检材进行再检测的平均STR基因座检出率为94.9%，优于其他三类检测。烟蒂类检材在四种检测中效果均低于其他类型检材，特别是经RapidHITTM200系统产生的PCR产物进行检测时平均STR基因座检出率仅为11.1%。具体结果见表3。

图1 口腔拭子A2经RapidHITTM200系统两次运行后的DNA分型图谱

表2 口腔拭子经RapidHITTM200系统两次运行后模板DNA首次、再次检测和PCR产物首次、再次检测的STR基因座检出率 （%）

表3 法医学常见检材的STR基因座检出率 （%）

3 讨 论

本研究发现，口腔拭子经RapidHITTM200系统先后运行两次的STR基因座检出率高，一致性检测结果好，但是再次运行检测的峰值较首次降低，而且再次运行后的检材可能存在部分等位基因丢失现象。同时，口腔拭子经RapidHITTM200系统两次运行后，模板DNA和PCR产物首次检测的效果均优于再次检测的结果，提示DNA实验流程中的每一步均会存在一定程度的DNA损失，降低STR基因座检出率。另外，在对法医学常见检材的检测中发现，血拭子和烟蒂较组织与口腔拭子的STR基因座检出率低，主要由于：血拭子检材常含有血红素，会抑制PCR扩增或降低PCR扩增效果[9]；烟蒂检材常受到抑制或降解，以及可能携带少量烟草和皮肤角化组织DNA所致[10]。

综上，RapidHITTM200系统对于口腔拭子检材的两次检测可获得较好的一致性检测效果；首次运行后的相应检材、模板DNA、PCR产物延续后续实验流程所获得的STR基因座检出率呈递减趋势且均小于95%，一次性检测结果差；模板DNA和PCR产物进行首次和再次检测的STR基因座检出率相差大，一次性检测结果差。结果提示，经RapidHITTM200系统首次运行后的检材、模板DNA、PCR产物以及经RapidHITTM200系统再次运行后的模板DNA与PCR产物不应直接用于法医学后续应用及研究。采用RapidHITTM200系统进行法医学应用时，在有条件的情况下，优先选择组织与口腔拭子检材。

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