直接扩增法提取脱落细胞DNA

泉州市公安局 焦 志

1 材料和方法

1.1 样本

所用样本均来自日常案件检材。

1.2 仪器设备及试剂

（1）主要试剂：Identifiler Plus扩增试剂盒，M48核酸纯化试剂盒。

（2）主要仪器：PE9700型DNA扩增仪，ABI3130XL遗传分析。

1.3 DNA的提取

工具类等具有光滑表面的样本采用棉签两步擦拭法擦取，剪取一半放入八连管中，另一半放入1.5mL离心管中。

手套类样本采用 EZ-tape粘取，剪取一半滤膜放入八连管中，另一半放入1.5mL离心管中，按照M48核酸纯化试剂盒的操作手册进行DNA提取。

1.4 PCR扩增

放入八连管中的检材（其中两步擦拭法的棉签适当在PE9700型DNA扩增仪上56℃进行烘干）按照Identifiler Plus试剂盒的操作手册进行，PCR反应体系总体积以盖过检材为准。经过M48核酸纯化试剂盒提取的DNA样本，PCR反应体系总体积为10μL。

1.5 STR分型检测

PCR扩增产物采用毛细管电泳进行分析，在ABI3130XL遗传分析仪上完成。

2 结果和讨论

从表1可以看出，对于工具类检材，M48提取、直接扩增两种方法的检出率分别为50%、60%，其中有5份检材直接扩增法检出而M48提取未检出。对于固相物体表面擦拭物检材，M48提取、直接扩增两种方法的检出率分别为30%、50%，其中有2份检材直接扩增法检出而M48提取未检出。对于这两类检材，直接扩增法的检出率都要高于M48法。从表2可以看出，直接扩增法提取检出、M48提取未检出的检材样本15个基因座都得到了完整的分型，荧光检测信号均值在100～500RFU之间。对于这两类检材M48的提取需要裂解、结合、洗涤、洗脱这四个步骤，检材裂解完毕后需要吸取上清到一新的离心管中进行结合阶段，换管的过程中必然存在着 DNA模板的损失。在洗涤阶段，大量多次的洗涤虽然可以去除大部分的杂质等影响扩增的因素，但也会不可避免存在 DNA模板的或多或少的损失，在洗脱阶段同样存在洗脱率的问题。这些因素都会造成检材样本模板的损失，对于低拷贝模板的检材显得尤为重要，以致这些检材得不到正确的分型结果或者没有分型结果。直接扩增法在处理同样检材样本特别是对于模板量很小的检材时，由于几乎不需要提取，直接将检材放入八连管进行扩增，减少了多步骤提取在时间和过程中对于模板 DNA的损失，最大程度保留了模板DNA。因此对于工具类、固相物体表面擦拭物这两类检材，在检材表面相对比较洁净的情况下，直接扩增法相比M48法具有更好的效果。对于手套类检材，从表1可以看到，M48提取、直接扩增两种方法的检出率分别为80%、47%，其中有5份检材M48提取检出而直接扩增法未检出。

表2结果表明，M48提取检出而直接扩增法未检出检材样本15个基因座都得到了完整的分型，荧光检测信号均值在100～300RFU之间，M48法的检出率要远远大于直接扩增法。究其原因是由于手套类检材提取使用 EZ-tape粘取法粘取手套，粘膜表面粘取的杂质较多，而且粘膜载体较大，粘膜性状也比较特殊，而且直接扩增法体系相对较小，检材大小、表面洁净程度都会影响到后续的直接扩增。而M48法对于这类检材可以起到纯化的作用，通过洗涤过程可以去除影响扩增的大部分杂质，得到相对纯净的 DNA模板，大大提高了检出的成功率。

表1 直接扩增法、M48提取法检验结果之间的对比

表2 M48提取检出直接扩增法未检出、直接扩增法检出M48提取未检出STR检验结果之间的对比

表3结果表明，两种方法检出数检材15个基因座都得到了完整的分型，荧光检测信号均值大体在100～3000RFU之间，直接扩增法等位基因峰高略大于M48法。在时间方面，直接扩增法具有非常大的优势，12个样本提取时间只需要15分钟左右，而M48需要140分钟。在试剂的消耗方面，由于直接扩增法的体系取决于检材的大小、性状，本实验最大体系为50μL，相对于标准的10μL体系，费用的消耗会比较大。

表3 直接扩增法、M48提取法在提取时间、试剂成本、STR检测结果之间的对比

综上所述，对于表面相对洁净，杂质较少的检材比如工具类检材样本、固相物体表面擦拭物检材样本，可以采用直接扩增法，节省大量的时间，获得更高的检出成功率，但需要付出成本高的代价。对于表面杂质较多，载体相对较大的检材，M48纯化则是不错的选择。而对于模板量很少、杂质相对较少的检材样本，直接扩增法检出率要高于M48法。

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